ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28979—2012 欧芹壳针孢检疫鉴定方法 Detection and identification of Septoria petroselini 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28979—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心， 本标准主要起草人：林石明、廖富荣、陈青、黄蓬英、陈红运、王宏毅、吴媛 GB/T28979—2012 欧芹壳针孢检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了欧芹壳针孢的检测和鉴定方法 本标准适用于欧芹属种子、苗木及其产品中欧芹壳针孢的检测和鉴定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 SN/T1809进出境植物种子检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 欧芹壳针孢基本信息 3 拉丁学名：Septoriapetroselini（Libert）Desmazieres 中文名称：欧芹壳针孢 属真菌界（Fungi），无性真菌门（Anamorphicfungi），未分目（曾归为球壳孢目Sphaeropsidales），未 欧芹壳针孢自然侵染欧芹（Petroselinumcrispum）和芜要（Coriandrumsatiuum），引起欧芹壳针孢 叶斑病。该病菌主要通过感染的种子进行远距离传播，种子是重要的初侵染源。 欧芹壳针孢的其他相关信息参见附录A。 4方法原理 本标准通过分离培养，根据菌落形态特征，病原菌无性世代的分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子 的形态特征，结合病菌所引起的主要危害症状，对该病原进行鉴定。 5主要试剂、仪器设备和用具 5.1主要试剂 次氯酸钠，蔗糖，甘油，琼脂，酒精等。 5.2仪器设备 超净工作台，高压灭菌锅，光照培养箱，生物显微镜（20×～400×）等。 5.3用具 白瓷盘，培养血，酒精灯，吸水纸，载玻片，盖玻片，刀片，手术剪，镊子，尖头镊子，刷子，PH计，血球 1 GB/T28979—2012 计数板，塑料袋，离心管等。 6抽样与检查 按SN/T1809或SN/T2122规定的抽样方法进行抽样检查。 检查种子、苗木及其产品是否有病斑、小黑点（分生孢子器）等（参见附录A）。若有小黑点，直接切 片在显微镜下检查。受感染的叶片初为黄色小斑，随后变成浅黄色至黄褐色，最后为褐色的病斑。病斑 边缘颜色稍深，为坏死圈。病斑圆形至长圆球形，或不规则，平均3mm～8mm，最大的直径约13mm， 边缘具窄的褐色的坏死线。在叶柄上为卵圆形、暗褐色的小病斑。叶面上病斑产生黑色小点（即分生孢 子器）。在种子表面具黑色小病斑或小黑点。 7病菌分离 7.1植物组织中病菌的分离 将植物组织用1%的次氯酸钠消毒2min~5min，用无菌蒸馏水冲洗，在无菌条件下晾干，放置在 PDA培养基上，于20℃25℃下培养3d～5d后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化。 7.2种子中病菌的分离 7.2.1洗涤检查 称取50g或适量的种子，加无菌水100mL，在振荡器中振荡5min，取洗涤液在1000r/min离心 3min，弃上清液，在沉淀中加入适量（约1mL）的席尔氏液（配制方法见GB/T18085一2000的附录A） 7.2. 2分离培养 检查异常的种子，挑取表面具有小黑点的种子，或随机挑取种子，每份样品至少检测400粒种子。 用蒸馏水将吸水纸充分湿润（避免产生多余的水），种子均匀置于吸水纸或PDA培养基上（如直径9cm 的培养皿约25粒/皿），加盖后，在20C～22℃，在12h紫外光和12h黑暗下交替培养。或者先在 8病菌鉴定 8.1形态特征 8.1.1在PDA培养基上（见附录B)，菌落糠枇状，呈暗褐色（参见图A,3)。从病组织或分离纯化所得 的菌落挑取的分生孢子器，在立体显微镜下进行形态观察和切片（最好能够从孔口处切开），根据分生孢 子器、分生孢子梗和分生孢子的形态特征进行鉴定。 8.1.2分生孢子器埋生于表皮下或稍微突出，单室，球形至近球形，有些较扁，黄色至黑褐色，直径 55μm~200μm；具近圆形至椭圆形孔口，直径20μm~40um。分生孢子器壁由多角形的厚壁细胞所 组成，厚壁细胞直径为3μm～5μm，黄色至褐色。分生孢子梗短，瓶梗形，无色透明，从分生孢子器的 内壁伸出，产孢方式为全壁芽生合轴式。分生孢子具0～4个真隔膜，一般为1～3个隔膜，未成熟的可 能没有隔膜，无色透明，线状或近圆柱形，（1.0μm～1.5μm）×（22μm～51μm），长宽比例大于10，通 常稍微弯曲，基部钝圆而顶部渐尖。参见图A，4图A.6。 2 GB/T28979—2012 8.2致病性测定 8.2.1接种体制备 刮取在PDA培养3d的可疑菌落的分生孢子，用无菌水配制成10°CFU/mL～10°CFU/mL孢子 悬浮液。 8.2.2接种试验 叶片进行创伤，将孢子悬浮液喷雾接种于欧芹的叶片上，每盆接种5株，重复二次。用无菌水作空白对 照。如可能，采用欧芹壳针孢已知菌株作阳性对照。接种后用干净的塑料袋包扎封口，在饱和湿度，于 20℃下黑暗中培养48h后，去掉塑料袋，在65%70%的相对湿度下，移人培养箱，20℃～25℃下黑 暗中培养；注意观察，一般在14d后就产生典型的症状， 结果判定与样品保存 9 9.1结果判定 9.1.1未分离到可疑菌落 病菌分离培养7d后，仍未产生可疑菌落，则未检出。 9.1.2分离到可疑菌落 分离培养后的可疑菌落，其形态特征如果符合8.1描述的鉴定特征，经致病性接种试验又产生典型 的症状，而空白对照没有表现症状，则判定为检出；可疑菌落没有产生典型的症状，则判定为未检出。 9.2记录及样品保存 检测报告应包含所采用的病菌分离方法，包括菌落形态特征、致病性测定所产生的症状照片等。供 试样品和所分离到的菌种，应保存在低温冰箱中，以备复核。 3