ICS 11. 220 B 50 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27623.1—2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分：常量肉汤稀释法 药物敏感性试验 Pharmacodynamic test technical specification for aquaculture antimicrobial agent-Part 1 :Antibiotics susceptibility test of macro-broth dilution method 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T27623.1—2011 前言 GB/T27623《渔用抗菌药物药效试验技术规范》分为两个部分： 第1部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验； 第2部分：人工感染防治试验。 本部分为GB/T27623的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本部分主要起草人：刘淇、李健、王群、戴芳钰。 I GB/T27623.1—2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分：常量肉汤稀释法 药物敏感性试验 1范围 GB/T27623的本部分规定了渔用抗菌药物的常量肉汤稀释法药物敏感性试验所需的试剂和材 料、仪器设备、操作步骤和质量控制。 本部分适用于渔用抗菌药物的常量肉汤稀释法药物敏感性试验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 中华人民共和国兽药典（2010年版）中华人民共和国农业部公告第1521号 3试剂和材料 3.1化学试剂 除非另有说明，本部分使用确认为分析纯的化学试剂。 3.2实验用水 除非另有说明，应符合GB/T6682中三级水的规格。 3.3Mueller-Hinton琼脂（M-H琼脂）培养基 按产品说明用干粉培养基制备平板，其中用于弧菌试验的M-H琼脂培养基中需添加1.5%的氯 化钠。 3.4Mueller-Hinton肉汤（M-H肉汤）培养基 按产品说明用干粉培养基制备M-H肉汤，其中用于弧菌试验的M-H肉汤培养基需添加氯化钠至 终浓度为1.5%。每一批M-H肉汤培养基的pH值在室温下应为7.2～7.4,应含有20mg/L~25mg/L 够时，应向培养基中添加适量无菌的Ca2+和Mg²+溶液（镁离子和钙离子溶液的制备方法见附录A）；添 加了Ca2+和Mg2+的M-H肉汤培养基不可再次高压灭菌。 3.50.85%无菌生理盐水 称取8.50g（精确到0.01g）分析纯氯化钠，加人1L蒸馏水溶解后121℃15min高压灭菌。 1 GB/T 27623.1—2011 3.6实验菌株 提供的分类地位明确的致病菌株，也可以使用临床分离的致病菌株，使用临床分离的致病菌株时应至少 鉴定至属。其中质控菌株为荧光假单胞菌（AS1.180）和副溶血弧菌（AS1.1614），质控菌株应来自国家 级微生物菌种保藏中心或具有资质的菌种保藏机构。 3.6.2日常使用的质控菌株荧光假单胞菌应在M-H琼脂上，副溶血弧菌应在添加1.5%氯化钠的 月更换一次，由冻干或超低温冷冻保存菌种移种或购买新菌种 4仪器设备 4.1恒温箱：可满足28℃±1℃。 4.2移液器：量程40μL~200μL、100μL~1000μL1000μL~5000μL。 4.3无菌操作台：可满足无菌要求的洁净工作台、生物安全柜或无菌室等。 4.4分析天平：精确至1mg。 5操作步骤 5.1抗菌药物母液的制备 5.1.1抗菌药物母液的浓度 抗菌药物母液的浓度应至少为最高测试浓度的10倍，但对于某些溶解性低的抗菌药物可以制备较 低浓度的母液。 5.1.2溶剂和稀释液 用于制备抗菌药物母液的溶剂和稀释液见附录B。除蒸馏水可高压灭菌外，其余应采用0.22um 微孔滤膜过滤除菌。 5.1.3母液的制备 称取不低于0.10g抗菌药物，精确到1mg；在无菌条件下使用5.1.2中溶剂和稀释液配制抗菌药 物母液。 5.2抗菌药物药液浓度的建立 抗菌药物药液的浓度按倍比稀释来建立，试验要在无菌条件下于适宜的玻璃试管中进行。试验中 取10支试管排成一列，在第1管中加人适量的渔用抗菌药物母液和M-H肉汤（总体积以2mL～10mL 为宜），使其浓度为试验的最高浓度。第2～10管均加人第1管总体积二分之一的M-H肉汤。第1管 混勾后取二分之一的量加入第2管中，混勾后从第2管中取二分之一的量加人第3管中，依次类推到第 8管，混匀后第8管吸取二分之一的量弃掉，第9、10管不加药物，第9管作为细菌生长情况对照，第 10管作为无菌控制对照。 2 GB/T 27623.1—2011 5.3菌液接种 5.3.1起始培养菌落 接种的菌落由新鲜的M-H琼脂培养基平板划线待测菌的单菌落来制备，孵育温度为28℃，除非是 缓慢生长菌株，否则平板培养时间不应超过24h。 5.3.2接种菌液的制备 接种菌液通过在0.85%无菌生理盐水中，乳化至少3个起始培养单菌落来制备。用0.85%无菌生 1X10°CFU/mL~2×10%CFU/mL。然后用M-H肉汤稀释至所需浓度。 5.3.3菌液接种 菌液接种后的最终浓度约为5×10°CFU/mL。一旦接种菌液在M-H肉汤中被稀释，则15min 内，接种菌液应加人每个试管中，但作为无菌控制的试管除外。 5.4孵育 接种菌液后应尽快放入28℃恒温箱中孵育，标准孵育时间为24h，但对缓慢生长菌株（如爱德华氏 菌）孵育时间为48h。 5.5读取试验结果 抗菌药物敏感性试验结果用最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）表示，即肉眼 观察试管中细菌生长完全被抑制时的最小抗菌药物浓度记录为MIC；同时测定质控药物对质控菌株 的MIC。 SAC 6质量控制 6.1最小抑菌浓度（MIC)的控制限值 根据实验菌株的特性，选用荧光假单胞菌（AS1.180）或副溶血弧菌（AS1.1614）为质控菌株，使用 盐酸土霉素为质控药物。盐酸土霉素对荧光假单胞菌的MIC质控范围均为2.0mg/L～8.0mg/L；对 副溶血弧菌的MIC质控范围均为1.0mg/L～4.0mg/L；当质控药物对质控菌株的MIC超出质控范围 时，MIC结果需舍弃重做。 6.2污染和细菌生长控制 无菌控制的培养基试管出现污染或不含抗菌药物的试管细菌未见明显生长时需舍弃全部MIC结 果；任何一列（排）出现跳管现象时，该列（排）MIC结果应舍弃 7结果报告 试验结果的报告包括受试药物对实验菌株的MIC、质控药物对质控菌株的MIC和实验菌株的名 称、来源、孵育时间。 3