ICS 13.040.20 Z 10 T/HBJC 黑龙江省标准技术创新协会团体标 准 T/HBJC 003—2 020 畜禽粪便废弃物堆肥处理中 抗生素抗性基因的测定方法 2020-12-01 发布 2020-12-16 实施 黑龙江省标准技术创新协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/HBJC 003—2020 I 目次 前言 ................................................................................ II 引言 ................................ ............................................... III 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 试剂和材料 ........................................................................ 1 6 仪器和设备 ........................................................................ 2 7 样品 .............................................................................. 2 8 检测方法 .......................................................................... 2 9试验数据处理 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .3 10 检测结果与分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .4 11 质量保证与质量控制 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 附录A（规范性附录） 原始采集数据格式参考 .............................................. 5 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/HBJC 003—2020 II 前 言 本文件依据 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些部分可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由东北农业大学提出 。 本文件由黑龙江省标准技术创新协会 归口。 本文件主要 起草单位： 东北农业大学、黑龙江省菌益粮康科技发展有限公司。 本文件起草人: 魏自民、温铁军、张旭、史明子 、齐海石、吴迪 。 全国团体标准信息平台 T/HBJC 003—2020 III 引 言 固体废弃物堆肥过程需要对产生的抗生素的抗性基因进行检测, 本文件的制定为企业测定堆肥中抗 生素抗性基因的浓度提供依据。 全国团体标准信息平台 T/HBJC 003—2020 1 畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法 1 范围 本文件规定了畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法。 本文件适用于四环素类（ tetM、tetQ、tetS、tetW、tetO、tetX、tetA、tetG、tetH）、磺 胺类（ sul1、 sul2、sul3）、氯霉素类（cmlA 、floR、fexA、cfr、fexB ）、大环内酯类（ ermQ、ermX、 ermF）、喹 诺酮类（gyrA）抗性基因的测定。 本文件的CT 值＜40。堆肥样品中抗生素抗性基因含量应大于500 拷贝数/g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 G B/T 6682 分析试验用水规规和试验方法 3 术语和定义 下列术 语和定义适用于本文件。 3.1 好氧 堆肥 依靠专性和 兼性好氧微生物的作用，使有机有机废弃物降解的堆肥过程。 3.2 抗 性基因 指畜禽 粪便废弃物堆肥中，微生物在抗生素选择压力的作用下发生基因突变，并产生大量 ARGs。 4 原理 使用实时定量分析仪（qPCR ）对堆肥过程中 抗生素抗性基因检测，根据不同抗生素抗性基因类型， 使用不同引物对其进行扩增，获取其DNA 片段，再与标记有荧光素的Taqman 探针进行混合，完成高温变 性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律。与模板DNA 互补配对的 Taqman探针被切 断，荧光素游离于反应体系中，抗性基因在特定光激发下发出荧光。经堆肥处理后的抗性基因含量与未经堆肥处理的抗性基因进行比较，以抗性基因拷贝数为最终检测指标。 5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1 水：GB/T 6682 ，一级。 全国团体标准信息平台 T/HBJC 003—2020 2 5.2 基因组DNA提取试剂盒 。 5.3 氯仿。 5.4 异丙醇。 5.5 无水乙醇。 5.6 焦碳酸二乙酯水（DEPC）。 5.7 0.45μm一次性聚四氟乙烯（ PTFE）微孔滤膜。 5.8 荧光定量 PCR试剂SYBR Green Mix。 5.9 50 mg/mL EDTA 。 6 仪器和设备 6.1 实时荧光定量 PCR仪。 6.2 高速冷冻离心机。 6.3 恒温水浴锅。 6.4 生物安全柜。 6.5 涡旋仪。 6.6 微量可调移液器及配套带滤吸头。 6.7 荧光PCR管及管盖。 6.8 1.5mL EP 管。 6.9 冰箱。 7 样品 针对于不同规模堆肥厂中堆肥初期及堆肥腐熟后产品中抗生素抗性基因进行检测。 针对不同堆体规 模规格的畜禽粪便废弃物堆肥，按照四等分法进行堆肥样品采集。取样 后应立即置于液氮或低温取样盒 中，及时进行抗生素抗性基因检测。若不能及时检测，应将堆肥样品于-20℃保存直至分析。在取样过 程中所有使用的工具在每次使用后都需高压灭菌或用75% 的乙醇清洗 。 8 检测方法 8.1 样品总 DNA 提取 堆肥样品中抗生素抗性基因含量应大于500 拷贝数 /g。本文件对抗生素含量提取及测定具体步骤如 下： a)取3g堆肥样品置于 50mL离心管中，向其中加入 10mL脱腐缓冲液、10mLPBS 缓冲液； b)涡旋混匀后 1000rpm 离心 10min； c)缓慢将上清液转移到新的 50mL离心管中，向原离心管中再次加入 10 mL脱腐缓冲液、 10 mL PBS 缓冲液； d)涡旋混匀后再次 1000rpm 离心 10min； e)将两次获得的上清液合并。将合并后的上清液 10000rpm 离心 5min，弃上清，得到脱腐后的堆 肥样品； f)接下来采用 Omega土壤 DNA提取试剂盒对经脱腐后的堆肥样品进行 DNA提取； 全国团体标准信息平台 T/HBJC 003—2020 3 g)用1%琼脂糖凝胶电泳对 DNA提取效果进行检测，运用微量分光光度计对 DNA的OD260和 OD280进行测定，OD260/OD280 比值应在 1.6～1.8； h)将提取的 DNA储存于 -20ºC冰箱中。 8.2 抗性基因标准曲线绘制 抗性基因标准曲线绘制按下列步骤： a)获取目的基因片段：用附表 A.1中所列的 ARGs引物对目的基因片段进行 PCR扩增，模板为 堆肥样品的总 DNA，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物进行验证 ； b)将PC R产物进行胶回收纯化； c)将 胶回收产物连接到 PMD18 -T载体上，将连接产物转入 E.coli DH5 α感受态细胞； d)蓝白斑 筛选阳性克隆子并分离纯化，进行测序验证； e)从阳性 克隆子中提取重组质粒，再次对重组质粒进行 PCR验证； f )计算质粒拷贝数（