ICS 67.120 X22 团 体 标 准 T/NAIA 003—2020 肌肉中肌苷 肌苷酸的测定高 效液相色谱法 Determination of inosine and inosinic acid in muscle High performance liquid chromatography 2020-07-07 发布 2020-08-01 实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 全国团体标准信息平台 1前 言 本标准的编写格式符合 GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第 1 部分 标准的结构和编 写》规定编写。 本标准由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本标准由宁夏大学、宁夏饲料工程技术研究中心、宁夏兽药饲料监察所、宁夏饲料工作 站、宁夏农林科学院、宁夏昊标检测服务研究院、宁夏化学分析测试协会起草。 本标准主要起草人：辛国省、卜姣姣、刘辉、燕翀、杨仪、丁园、高巧仙、王建林、武晓 宏、谢荣国、张小飞、张艳、王京。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 2肌肉中肌苷 肌苷酸的测定 高效液相色谱法 1　范围 本标准规定了肌肉中肌苷 肌苷酸高效液相色谱法的测定。 本标准适用于肌肉中肌苷 肌苷酸的测定。 本方法检测限为： 0.05g/kg 。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单位）适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9695.19 肉与肉制品、取样方法 3　原理 肌肉组织中肌苷 肌苷酸经高氯酸溶液提取后，与碱反应生成化学状态稳定的肌苷酸钠， 在 254nm波长下紫外检测器检测，外标法定量。 4　试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水 4.1　高氯酸。 4.2　5%高氯酸溶液：取 5mL高氯酸加入 95mL水中。 4.3　磷酸。 4.4　三乙胺。 4.5　甲醇（色谱纯）。 4.6 肌苷标准品（纯度不低于 99.0%）。 4.7 肌苷标准储备液（ 0.8mg/mL ）：称取肌苷标准品（ 4.6）20mg（准确至 0.1mg）于 25mL 容量瓶中，用水定容。置于 4℃冰箱保存，有效期 3 个月。 4.8 肌苷酸标准品（纯度不低于 99.0%）。 4.9 肌苷酸标准储备液（ 1mg/mL）：称取肌苷酸标准品（ 4.8）50mg（准确至 0.1mg）于 50mL 容量瓶中，用水定容。置于 4℃冰箱保存，有效期 3 个月。 4.10 氢氧化钠。 4.11 氢氧化钠溶液： 2mol/L。 4.12 磷酸三乙胺混合溶液：分别取 3.5mL磷酸（4.3）和7.2mL三乙胺（ 4.4），加入 200mL 水中混匀，用三乙胺（ 4.4）调pH至6.5，用水定容至 1L。 5　仪器和设备 5.1　实验室用粉碎机或研钵。 5.2　分析天平：感量 0.0001 g。 全国团体标准信息平台 35.3　均质机。 5.4　高效液相色谱仪：配紫外检测器。 5.5　高速离心机。 5.6　超声波。 5.7　容量瓶： 50mL、25mL。 5.8　移液管：玻璃移液管 0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL。 5.9　砂芯过滤装置。 6　试样制备与保存 取肌肉组织，加液氮研磨或粉碎后置于 -80℃冰箱备用。 注：在采样和制备过程中，应避免试样污染，如长途运输应加液氮或冰袋保存。 7　测定步骤 7.1　试样提取 平行做两份试验。称取 2g（准确至 0.0001g），置于 50mL 离心管中，用 20mL预冷的5%高 氯酸溶液（ 4.2）分 3次匀浆，匀浆液在 4℃下以 4000r/min 离心 10min，上清液转入 50mL烧杯 中，合并上清液，用氢氧化钠溶液（ 4.11）调pH 至 6.5，用蒸馏水定容至 50mL，摇匀，经 0.45 μm 滤膜过滤装入进样小瓶待测。随同试样进行空白试验。除不称取样品外，均按试样步骤进 行。 7.2　色谱条件 色谱柱： C18，长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或性能相当； 柱温：25℃； 进样量： 20μl； 流动相：磷酸三乙胺溶液（ 4.12）+甲醇（4.5）=95+5混匀，经 0.45μm滤膜过滤，超声波 脱气； 流速：1mL/min； 检测波长： 254nm。 7.3　标准系列溶液 准确吸取标准储备液（ 4.7、4.9）0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL肌苷 肌苷酸储 备液分别置于 25mL 容量瓶中，用水定容。浓度分别为：肌苷： 0μg/mL、3.2μg/mL、6.4μ g/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL。肌苷酸： 0μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、20μg/mL、 40μg/mL、80μg/mL。现配现用。 7.4　测定 按照7.2给出参考色谱条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。 7.5　标准曲线绘制 试样溶液与标准溶液中肌苷、肌苷酸保留时间相对偏差在± 2.5%之内。在线性范围内， 以肌苷、肌苷酸浓度为横坐标，以其响应值（峰面积）为纵坐标；绘制标准曲线，标准曲线相 关系数不低于 0.999。 8　分析结果的计算 按式(1)计算试样中的肌苷、肌苷酸含量 w，其数值用 mg/kg表示。 mvckg mgw)/( )1( 全国团体标准信息平台 54 式中： C:标准曲线下查的肌苷或肌苷酸浓度 (μg/mL）； V:试样定容体积 (mL）； m:试样量，单位 (g)。 9　重复性 在重复条件下完成两个平行测定结果的相对偏差不大于 5%。 _________________________________ 全国团体标准信息平台