IICS65.020.01 CCSB16 T/JLFX002-2022 团 体 标 准 T/JLFX002—2022 松材线虫实验室检测鉴定技术规程 TechnicalTeregulationforLaboratorydetectionofBursaphelenchus xylophilus(SteinerandBuhrer)Nickle 2022-05-07发布 2022-05-07实施 北京林业有害生物防控协会  发布 全国团体标准信息平台 II目次 前言…………………………………………………………………………Ⅲ 1范围………………………………………………………………………1 2规范性引用文件……………………………………………………………1 3术语和定义…………………………………………………………………1 4检测鉴定对象………………………………………………………………4 5检测鉴定对象的取样与制备………………………………………………4 6松材线虫检测鉴定技术方法………………………………………………4 7.样品保存……………………………………………………………………11 8.附录：一《引物与探针》…………………………………………………12 9.附录：二《样品标签填写记录》…………………………………………13 10.附录：三《取费及维护》…………………………………………………14 11.附录：四《松材线虫形态学特征》……………………………………15 12.附录：五《松材线虫分子检测仪器及相关操作要求》…………………17 11.参考文献……………………………………………………………………26 全国团体标准信息平台 JLFX002-2022 III前言 本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 GB/T20000《标准化工作指南》、GB/T20001《标准编写规则》给出的规则起草。 本标准由北京林业有害生物防控协会归口并管理。 本标准由北京中林佳诚科技有限公司负责起草，本标准由北京市园林绿化资源保护中心、北京市昌 平区林业保护站、南京生兴生物技术有限公司及北京蓝狐天敌技术有限公司参加起草。 本标准首次发布。 本标准主要起草人：张永、仪志颖、柴忠心、崔国卿、乔润喜、赵哀梅、褚明昕、谷昊静、马润国、 袁菲、薛正、李银鸽、陈超、朱绍文。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 JLFX002-2022 1松材线虫实验室检测鉴定技术规程 1范围 本标准规定了松材线虫分子检测鉴定的技术规程。本标准适用于进出境植物检疫、国内植物检疫以及 林业有害生物调查中松材线虫及其寄主植物和制品携带松材线虫的分子检测鉴定工作。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文 件。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包 括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T35342—2017松材线虫分子检测鉴定技术规程 DB/T3378-2021辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程 LY/T2107—2013化学信息诱引松材线虫快速取样技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 松材线虫Pinewoodnematode[Bursaphelenchusxylophilus(SteineretBuhrer)Nickle] 一种无脊椎动物,属于线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、滑刃目(Aphelenchida)、滑刃总科 (Aphelenchoidoidea)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus) 的植物寄生线虫。 3.2 松材线虫病pinewiltdiseasecausedbypinewoodnematode 全国团体标准信息平台 2又名松树萎蔫病,是由松材线虫寄生在松树体内所引起的一种松树毁灭性森林病害。 3.3 分子检测moleculardetection 以功能基因、核糖体ITS等区域为靶标,采用分子生物学的方法在基因水平上对物种进行鉴定。 3.4 寄主植物及其制品pinewoodandwoodproducts 松材线虫寄主植物及其原木、锯材和用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料,如木板箱、 木条箱、木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木和衬木等。经人工合成或经加热、加压等深度加 工的包装木质材料,如胶合板、纤维板等除外。 3.5 引物primer 一段短核苷酸序列。其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,在聚合反应时,引导合成一条与模板互补 的DNA的序列。 3.6 TaqMan探针TaqManprobe 一段寡核苷酸序列,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射 的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧 光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,荧光信 号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系。 3.7 循环阈值Cyclethresholdvalue 循环阈值(Ct值)的含义是指在PCR扩增过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应 的循环次数。Ct值是实时荧光PCR检测结果判读的依据。 3.8 聚合酶链式反应polymerasechainreaction;PCR 在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤, 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地 在体外扩增目的DNA片段。 3.9 全国团体标准信息平台 JLFX002-2022 3实时荧光PCRreal-timePCR PCR反应时,加入一对特异引物与荧光探针。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每个循环 扩增产物量的变化,通过对Ct值和标准曲线的分析从而对起始模板进行定量分析。 3.10 交叉引物恒温扩增技术crossingprimingamplification;CPA 一种新的核酸恒温扩增技术。针对目的基因设计特异性引物(包括扩增引物和交叉引物),利用具有链置 换功能的BstDNA聚合酶,在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。 3.11 反应体系reactionvolumes 一个PCR反应的总体积(μL)以及所包含的各种反应成分的浓度。包含10×扩增缓冲液、4种dNTP混合 物、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+、双蒸水等,实时荧光定量PCR还包含探针的浓度。 3.12 反应程序reactionprocedures PCR反应过程中,变性、退火(复性)、延伸三个基本反应步骤、循环开始前的预变性、循环结束后的延 伸等各个反应步骤需要的温度以及在该温度条件下所持续的时间,还包含循环的数量。 3.13 阳性对照positivecontrol 试验的一个控制处理,用于检验试验本身的正确与否。即在用分子生物学技术手段对物种进行检测鉴定 时,一个试验处理的模板为该物种的DNA。 3.14 阴性对照negativecontrol 试验的一个控制处理,用于检验试验本身的正确与否。即在用分子生物学技术手段对物种进行检测鉴定 时,一个试验处理的模板用无菌水替代。 3.15 结果判读resultsjudgement 对分子检测方法所获得结果的判断。交叉引物恒温扩增检测方法的判读依据是扩增产物中是否含有特 征条带,实时荧光PCR检测方法的判读是根据反应结束后Ct值的有无以及大小综合判别。 4检测鉴定对象 全国团体标准信息平台 4疑似松材线虫，或疑似带有松材线虫及其传播媒介昆虫活体的寄主植物及其制品。 5检测鉴定对象的取样与制备 5.1以线虫分离物为分子检测对象的样本制备 5.1.1线虫分离方法 快速分离法及贝尔曼漏斗法见6.3。 5.1.2线虫的取样 将贝尔曼漏斗法或快速分离法分离获得的线虫虫悬液,自然沉淀30min或以1500r/min的转速离心2min, 然后将移液器枪头插入离心管底部,吸取20μL的线虫虫悬液,置于另一编号的1.5mL的离心管,用于提取线虫 的DNA。化学信息诱引检测管法收集的线虫,可直接加入20μL的灭菌双蒸水,用于提取线虫的DNA。 5.1.3阳性对照材料 以松材线虫的DNA作为检测的阳性对照材料。 5.1.4阴性对照材料 以ddH2O作为检测的阴性对照材料。 6.松材线虫检测鉴定技术方法 6.1实验室基本配置 6.1.1基本设备 冰箱（上层4℃、下层-20℃）、漏斗架、灭菌锅，烘箱、打印机、电钻等。 6.1.2基本仪器 显微镜、金属浴、离心机、混匀仪、松材线虫自动化分子检测系统等。 6.1.3材料 漏斗、移液枪（不同规格）、白枪头、黄枪头、蓝枪头、离心管（0.2mL、1.5mL、2mL、15mL）、 载玻片、盖玻片、斧头、砍刀、剪刀、记号笔、标签纸等。 6.2取样 6.2.1取样位置： 在树干的下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），用斧子、柴刀、木钻（钻头直径1~1.5cm） 在木质部采集样品。 全国团体标准信息平台 JLFX002-2022 56.2.2取样步骤： （1)剥净取样部位的树皮和外围木质部； （2)直接砍取100~20