ICS 65.020.30 B 44 备案号:36785-2013 北 京 DB11 市 地 方 标 准 DB11/T 960—2013 梅花鹿胚胎移植技术规程 Code of practice on embryo transfer in the sika deer 2013 - 01 - 31 发布 北京市质量技术监督局 2013 - 05 - 01 实施 发 布 DB11/T 960—2013 目 次 前言................................................................................. II 1 范围............................................................................... 1 2 术语和定义......................................................................... 1 3 供体鹿选择、超数排卵及配种 ......................................................... 2 4 手术法冲胚......................................................................... 2 5 胚胎质量鉴定....................................................................... 3 6 受体鹿移植......................................................................... 3 7 记录............................................................................... 4 附录 A（资料性附录） 梅花鹿胚胎移植记录表 ............................................ 5 I DB11/T 960—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局负责组织实施。 本标准起草单位：北京市畜牧兽医总站、中国农业大学。 本标准主要起草人：刘国世、蒋益民、薛水玲、王俊、史文清、朱士恩、云鹏、王梁、薛振华、任 康、赵广华、商业、张鲁。 II DB11/T 960—2013 梅花鹿胚胎移植技术规程 1 范围 本标准规定了供体鹿选择、超数排卵及配种、手术法冲胚、胚胎质量鉴定、受体鹿移植方法和记录。 本标准适用于梅花鹿的胚胎生产和移植。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 供体鹿 donor 在胚胎移植过程中提供胚胎的母鹿个体。 2.2 受体鹿 recipient 在胚胎移植过程中接受胚胎的母鹿个体。 2.3 试情公鹿 teaster deer 用于母鹿发情鉴定,输精管结扎的公鹿。 2.4 超数排卵 multiple ovulation 在母畜发情周期的适当时间，应用外源促性腺激素处理，使卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并 排卵，也简称为“超排”。 2.5 阴道栓 vaginal suppository 一种内含孕酮、用特制的放置器将其放入阴道的同期发情装置。 2.6 胚胎移植 embryo transfer 将体内、外生产的哺乳动物早期胚胎，移植到另一头同种的生理状态相同或相似的雌性动物生殖道 内，使之继续发育成为新个体的技术。 1 DB11/T 960—2013 3 供体鹿选择、超数排卵及配种 3.1 供体鹿选择 体况良好、生殖机能正常，系谱完整、有种用价值且年龄在3～5周岁的成年母鹿。 3.2 超数排卵 放置阴道栓（当天记为第0天）后第9天开始注射促卵泡素（FSH），每天注射两次间隔12h，早晚各 1次，4天8次等量或减量注射。到第12～13天结束，共注射FSH 320mg。第7次注射FSH时取出阴道栓。 3.3 发情鉴定 阴道栓取出后24小时开始用试情公鹿每隔6h试情一次，每次持续0.5h～1h。母鹿稳定接受爬跨即为 发情。 3.4 配种 供体鹿发情后8h～12h麻醉，直肠把握人工授精配种。间隔8h～12h重复输精一次。每次输精冻精剂 量为2支/头（每支冻精的有效精子数在1000万以上）。 4 手术法冲胚 4.1 冲胚器材、药品及试剂 4.1.1 器材 套管针、冲胚管、注射器、肠钳夹、培养皿、手术刀、手术缝合针和缝合线、体式显微镜、恒温板 等。 4.1.2 药品及试剂 含0.3%胎牛血清的磷酸缓冲液（PBS）、胚胎保存液（Holding液）、青霉素、链霉素、石蜡油、麻 醉药、解麻药等。 4.2 冲胚 4.2.1 术前准备 供体母鹿第一次配种后6d～7d手术法冲胚，母鹿术前禁食24h。 4.2.2 麻醉与保定 术前进行全身麻醉。冲胚时将母鹿放于保定架，呈前低后高仰卧保定。 4.2.3 术部消毒 术部位于腹部中线距乳房约4cm处。麻醉后的母鹿术部备皮，用温水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒。 4.2.4 手术方法 4.2.4.1 冲胚在冲胚室内进行。 2 DB11/T 960—2013 4.2.4.2 在腹部中线距乳房基部前约 4cm 处做一切口，然后将两侧子宫角和输卵管暴露，观察左右卵 巢上的黄体发育情况并记录。 4.2.4.3 在一侧子宫角基部用止血钳穿孔，插入冲胚管，由充气管注入 5ml 左右空气,使气囊封阻子宫 腔；在子宫角和输卵管结合部的子宫角端插入套管针，拔出针芯，将装有 PBS 的 50ml 注射器接到套管 针上，然后注入 35℃～37℃的 PBS 30ml～50ml，将胚胎从子宫角的上端冲出，由冲卵管的出液孔收集 于培养皿（直径 90mm）中,放气后取下冲胚管。 4.2.4.4 用同样方法冲取另一侧子宫角的胚胎。 4.2.4.5 冲胚完成后将子宫角放回体内，并用 0.9%的生理盐水进行冲洗,并注入 2ml 石蜡油以防止生 殖道粘连。 4.2.5 缝合与消毒 左右子宫角创口各缝1针,腹膜和肌肉层连续缝合，皮肤结结缝合，用5%碘酊消毒。术后3天内每天 注射2次青霉素、链霉素等抗生素。 5 胚胎质量鉴定 5.1 检胚 将冲胚后回收液平皿放在30℃的恒温板上，在20℃～25℃的无菌操作室内的体式显微镜下进行检 查。检出的胚胎用吸卵器移入PBS中进行鉴定，确定受精与否及胚胎发育阶段。 5.2 胚胎质量分级 5.2.1 配种后 6d～7d 的胚胎发育阶段应为桑椹胚或囊胚。 5.2.2 胚胎质量分为 A、B、C、D 四个等级,A、B、C 级胚胎为可用胚胎，D 级为不可用胚胎。 ——A 级：胚胎发育阶段与胚龄一致，胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构 紧凑，色调和透明度适中，无游离的细胞和液泡,或很少，变性细胞比例少于 10%； ——B 级：胚胎发育阶段与胚龄基本一致。轮廓清晰，分裂球大小基本一致，色调和透明度及细胞 密度良好，可见到一些游离的细胞和液泡，变性细胞占 11%～30%； ——C 级：胚胎发育和胚龄不太一致，轮廓不清晰，色调变暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较 多，变性细胞达 31%～50%； ——D 级：有碎片的卵、细胞无组织结构，变性细胞占胚胎大部分，约 75%。 6 受体鹿移植 6.1 移植器械、药品及试剂 6.1.1 器械 手术刀、手术缝合针和缝合线、腹腔内窥镜、宫颈钳、移植针等。 6.1.2 药品及试剂 孕马血清促性腺激素(PMSG) 、胚胎保存液（Holding 液）、5%碘酊、青霉素和链霉素等。 6.2 受体鹿选择 体况良好、生殖机能正常，年龄在2～5周岁的母鹿。 3 DB11/T 960—2013 6.3 同期发情 受体鹿放置阴道栓进行同期发情，第12天撤栓 （放栓当天记为第0天）。撤栓时肌肉注射300IU的PMSG。 6.4 术前准备、麻醉、保定和消毒 同4.2.1、4.2.2和4.2.3的处理方法。 6.5 胚胎移植 6.5.1 移植方法 可采用腹腔内窥镜方法。 6.5.2 受体鹿黄体的观察 在乳房前方腹中线两侧各切开一个0.5cm～1cm长的小口，一侧插入打孔器和腹腔镜，另一侧插入宫 颈钳。通过腹腔镜和宫颈钳相互配合观察受体鹿的卵巢状态，记录黄体数目。挑选单侧卵巢1～3个黄体 的受体鹿进行胚胎移植。 6.5.3 移植与缝合 6.5.3.1 将卵巢上有 1～3 个黄体侧的子宫角取出，在子宫角的上 1/3 部位穿刺，连接上结合有 1ml 注射器的塑料移植针。 6.5.3.2 将含有 1～2 枚胚胎的 0.3ml～0.5m 的 Holding 液，通过 1ml 注射器缓慢注入子宫角。 6.5.3.3 受体鹿左右创口各缝 1 针，外涂 5%碘酊。 6.5.3.4 移植后肌肉注射黄体酮。 7 记录 胚胎移植过程中应记录供体鹿超数排卵、输精、冲胚、受体鹿移植情况,记录内容可参考附录A。 4 DB11/T 960—2013 AA 附 录 A （资料性附录） 梅花鹿胚胎移植记录表 表A.1 供体鹿超数排卵记录表 养殖场： 供体号： 品种： 出生时间（年龄）： 断奶时间： 胎次： 激素： 批号： 总剂量： 第一天剂量： 第二天剂量： 第三天剂量： 第四天剂量： 第五天剂量： 第六天剂量： 第七天剂量： 第八天剂量： 阴道栓： 批号： 发情状况： 超排处理时间： 总剂量： 放栓时间： 撤栓时间： 促排药： 注射日期： 剂量： 发情时间： 发情表现： 输精时间： 公鹿号： 精液品质： 检胚人： 胚胎数量： 冲胚时间： 冲胚人： 表A.2 供体鹿冲胚记录 供体号： 卵巢 卵巢 PBS 回 收率 黄体数 （CL） 卵泡数 （F） 回收 卵数 未受 精卵 数 退化 卵数 冲胚时间： 胚胎发育及等级 2～16 细 胞 枚数 等级 A 桑椹胚 囊胚 B 左 C D A B 左 C D 5 DB11/T 960—2013 表A.3 供体鹿冲胚汇总表 供体号 经产/育成 冲胚时间 黄体数 胚胎数 胚胎等级 可用胚胎数 备注 表A.4 受体鹿移植记录 黄体数（CL） 序号 受体号 移植时间 左 右 移植胚胎数 左 右 胚胎等级 _______________________________