ICS 67.080.20 B15 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1381—2013 甘薯品种抗瘟鉴定技术规程 Technical standard for evaluation of sweet potato resistance to Ralstonia solanacearum Smith 2013-12-04 发布 福建省质量技术监督局 2014-03-01 实施 发 布 DB35/T 1381—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院作物研究所。 本标准主要起草人：刘中华、邱思鑫、余华、许泳清、邱永祥、罗文彬、纪荣昌、李华伟、汤浩。 I DB35/T 1381—2013 甘薯品种抗瘟鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了甘薯品种抗瘟鉴定的接种液制备、田间诱发、人工接种、病情调查、抗瘟性评价、鉴 定记录。 本标准适用于福建省甘薯品种的抗瘟鉴定。 2 术语与定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1 田间诱发鉴定 利用自然条件下能充分发病的田块种植甘薯品种，根据不同品种的自然发病程度判别品种抗瘟性的 方法。 2.2 人工接种鉴定 模拟自然发病条件，接种人工培养的薯瘟病菌，根据甘薯的发病程度判别品种抗瘟性的方法。 2.3 剪叶接种法 用带有薯瘟病菌的剪刀进行剪叶接种的方法。 2.4 浸根接种法 将具有新鲜剪口的甘薯种苗浸入到薯瘟病菌悬浮液中，使其感染薯瘟病菌的接种方法。 3 接种液的制备 3.1 3.1.1 培养基的配制 固体培养基 洗净去皮的马铃薯200 g，切成细块，加800 mL水煮沸20 min后，用双层纱布滤去薯块，置于适当 的加热容器中，再加入蔗糖20 g、蛋白胨5 g、牛肉浸膏3 g、琼脂16 g，加热至琼脂完全融解，转移到 量杯中，pH值调至7.2，定容至1000 mL，121℃高压灭菌25 min。 1 DB35/T 1381—2013 3.1.2 液体培养基 除不使用琼脂外，配方与制备方法均按3.1.1规定进行。 3.2 薯瘟病样的采集 采集具有典型症状的薯瘟病样，置入取样袋，贮放在4℃条件下，备用。 3.3 薯瘟病菌的分离 3.3.1 前处理 取褐变的维管束2 cm～3 cm，75%乙醇中消毒0.5 min，取出，用无菌水漂洗2次。 3.3.2 划线法分离 3.3.2.1 平板制备 取3.1.1制备的培养基100 mL融化后，待培养基冷却至约45℃，加入浓度为1%的2,3,5-氯化三苯四 氮唑1mL，混匀后倒入灭过菌的培养皿，制成平板。 3.3.2.2 划线分离 将3.3.1处理过的维管束剪成约2mm碎段，置于消毒过的载玻片上，加3～5滴无菌水，1 min～2 min 后，用灭菌过的接菌环沾取载玻片上的菌液，在3.3.2.1制备的平板培养基上划线。 3.3.2.3 纯化培养 将划过线的平板置于28℃培养箱中暗培养36 h～40 h，挑取带有红色斑点的乳白色单菌落（即典型 薯瘟病菌菌落）置于3.3.2.1制备的平板培养基上培养，用灭菌后的接菌环挑取典型薯瘟病菌单菌落至 3.1.1制备的斜面培养基上培养。 3.4 薯瘟病菌的致病型鉴定 纯化后的薯瘟病菌用剪叶法接种至新种花、金山57和湘薯75-55等3个甘薯瘟鉴别品种上，根据3个 鉴别品种发病程度区分致病型（详见附录A）。 3.5 薯瘟病菌悬浮液的制备 取斜面纯化后的薯瘟病菌，无菌条件下转移至装有150 mL的液体培养基中，在28℃、180 r/min振 9 荡培养36 h，选取有乳白色气泡的悬浮液，配成浓度为3×10 CFU/mL的菌液，备用。 4 田间诱发 4.1 病圃选择 选择常年种植甘薯、自然条件下能充分发病、排灌水条件方便的田块作为病圃。 4.2 品种栽插时间及方式 于每年的6月～7月，剪取待鉴定的甘薯苗，按株距15 cm～20 cm单行植入病圃，每处理植30株，随 机区组排列，3次重复，以感病品种新种花作对照。 2 DB35/T 1381—2013 5 人工接种 5.1 时间 Ⅰ型菌宜在每年6月～9月，Ⅱ型菌宜在7月～8月高温季节接种。 5.2 方法 5.2.1 浸根接种 种苗剪15 cm左右，浸入薯瘟病菌悬浮液中，20 min后取出植入未发生过甘薯病害的苗圃。每重复 植苗7～9株，每品种重复2～3次，以新种花为感病对照、金山57和湘薯75-55为抗病对照；植后15 d～ 20 d内应浇水保湿。 5.2.2 剪叶接种 用消毒过的剪刀沾取薯瘟Ⅰ型菌液后，剪待鉴定品种的叶片，每沾1次最多剪2～3片。每品种3盆， 每盆3株，每株剪2～3片。 6 6.1 病情调查 调查部位 甘薯的根部、茎部及叶片。 6.2 调查方法 6.2.1 浸根接种法的调查 用5.2.1方法处理60 d～90 d后，逐株检查地下部病情及剖茎检查维管束变褐程度，并计数枯死株。 6.2.2 剪叶接种法的调查 Ⅰ型菌盆栽苗剪叶接种7 d后只观察接种叶片的发病情况，不计算病情指数。 6.3 病情分级标准 发病程度的分级标准如下： 0级：植株正常无病； 1级：拐头维管束变褐，薯块受害不明显； 2级：茎维管束褐变扩展及地上部，薯块受害体积≤1/4； 3级：拐头腐烂，或薯块受害体积>1/4； 4级：植株枯死。 7 7.1 抗瘟性评价 病情指数计算公式 病情指数按公式（1）计算： DΙ = ∑ (s × n) × 100 4× N …………………………………（1） 3 DB35/T 1381—2013 式中： DΙ ——病情指数； s ——各病级代表的数值； n ——各级病株数； 4 —— 病情最高级别； N ——调查总植株数。 7.2 抗性评价标准 根据甘薯品种的病情指数，按表1标准评价其抗性。 表1 8 甘薯品种抗瘟性评价标准 病情指数（ DΙ ） 抗性等级 0≤ DΙ ≤0.5 高抗（HR） 0.5＜ DΙ ≤20.0 抗病（R） 20.0＜ DΙ ≤40.0 中抗（MR） 40.0＜ DΙ ≤60.0 中感（MS） 60.0＜ DΙ ≤80.0 感病（S） 80.0＜ DΙ ≤100 高感（HS） 鉴定记录 甘薯品种抗瘟鉴定过程应按表2规定的内容进行记录。 表2 编号 品种/种质名称 来源 甘薯品种抗瘟鉴定记载表 病情级别 重复 0 1 2 3 4 Ⅰ 1 Ⅱ Ⅲ Ⅰ … Ⅱ Ⅲ 播种日期： 接种日期： 接种生育期： 接种病原菌分离物编号： 生理小种类型： 调查日期： 调查人（签字）： 4 A 鉴定技术负责人（签字）： 病情指 平均病 抗性等 数 情指数 级 DB35/T 1381—2013 附 录 A （规范性附录） 甘薯瘟病原菌和生理小种 A.1 学名和形态描述 A.1.1 学名 青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum Smith）。 A.1.2 形态描述 菌体短杆状，有极生鞭毛，两端钝圆或尖圆（见图A.1）。在培养基上菌落较小、近圆形，稍有突 起、光滑、乳白色，具有致病力的病原菌流动性较强。6 d～7 d后渐变褐色后失去致病力。 图A.1 A.2 甘薯瘟病原菌电镜图片（10000×） 生理小种 A.2.1 鉴别寄主 采用新种花、金山57、湘薯75-55作为鉴别寄主。 A.2.2 生理小种鉴定 根据薯瘟菌对鉴别寄主的侵染性，以特定的侵染反应组合划分生理小种（见表 A.1）。 5 DB35/T 1381—2013 表 A.1 薯瘟菌生理小种鉴定表 鉴定品种 生理小种 新种花 金山57 湘薯75-55 1 +1） -1） - 2 + + - 3 + 1）+ 代表侵染；- 代表不侵染 6 DB35/T 1381－2013 福 建 省 地 方 标 准 甘薯品种抗瘟鉴定技术规程 DB35/T 1381—2013 * 2014 年 2 月第一版 2014 年 2 月第一次印刷