ICS 67.120 B 45 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2260—2015 鹿鞭鉴定方法 PCR 法 Identification of Sika Deer and Wapiti Pizzles----Polymerase Chain Reaction Method 2015 - 02 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2015 - 03 - 01 实施 发 布 DB22/T 2260—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：邢秀梅、吴琼、杨福合、苏伟林、邵元臣、查代明、荣敏、刘华淼、徐佳萍、 杨颖、涂剑锋、张铁涛。 I DB22/T 2260—2015 鹿鞭鉴定方法 PCR 法 1 范围 本标准规定了梅花鹿鞭、马鹿鞭（塔河马鹿除外）的 PCR 鉴定方法。 本标准适用于梅花鹿鞭、马鹿鞭（塔河马鹿除外）的真伪鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鹿鞭 pizzle 梅花鹿、马鹿的外生殖器，包括阴茎及睾丸。 4 原理 针对梅花鹿、马鹿线粒体DNA（mtDNA）的D-loop区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR） 技术扩增特异性DNA片段，根据是否扩增出特异性片段对鹿鞭进行鉴定。 5 试剂和材料 除非另有说明，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符合GB/T 6882中二级水的规定。 5.1 引物 上游引物：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’ 下游引物：5’-ATCTAGTGCTCGAATTAATGGTAC-3’ 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 试剂 氯化钠（NaCl），CAS 号 7647-14-5。 氯化镁（ MgCl2·6H2O），CAS 号 7791-18-6。 氢氧化钠（NaOH），CAS 号 1310-73-2。 1 DB22/T 2260—2015 5.2.4 琼脂糖，CAS 号 9012-36-6。 5.2.5 三羟甲基氨基甲烷（Tris），CAS 号 77-86-1。 5.2.6 十二烷基磺酸钠（SDS），CAS 号 2386-53-0。 5.2.7 乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA），CAS 号 15708-41-5。 5.2.8 盐酸（HCl），CAS 号 7647-01-0。 5.2.9 三氯甲烷（氯仿），CAS 号 67-66-3。 5.2.10 冰乙酸，CAS 号 64-19-7。 5.2.11 无水乙醇，CAS 号 64-17-5。 5.2.12 Tris 饱和酚，CAS 号 108-95-2。 5.2.13 Triton X-100，CAS 号 9036-19-5。 5.2.14 75%乙醇。 5.2.15 酚﹕氯仿混合液（体积比 1﹕1）：Tris 饱和酚、氯仿等体积混合，置于棕色瓶中，4℃保存。 5.2.16 dNTP 溶液（市售）：含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 2.5 mmol/L。 5.2.17 10×PCR Buffer 缓冲液（不含氯化镁）（市售）：100 mmol/L KCl，160 mmol/L (NH4)2SO4， 20 mmol/L MgSO4，200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，1% TritonX-100，1 mg/mL BSA。 5.2.18 Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）。 5.2.19 溴化乙锭（10 mg/ml ）：称量 100 mg 溴化乙锭溶解于 10 mL 水中，然后分装成 1 mL/份，4 ℃ 避光保存。 5.2.20 10 mM Tris：称量 24.22 g Tris 溶于 160 ml 蒸馏水中，加浓 HCL 调 pH 至 8.0，最后定容至 200 mL,常温保存。 5.2.21 0.5 mol/l EDTA：称量 186.1 g EDTA 溶于 800 mL 蒸馏水中，加 NaOH 调 pH 至 8.0，最后定容 至 1000mL，高压灭菌后，常温保存。 5.2.22 10% SDS：称量 10.0 g SDS 溶于 100 mL 蒸馏水中，55 ℃水浴锅中助溶。 5.2.23 20 mg/mL 蛋白酶 K：称量 100.0 mg 蛋白酶 K 溶于 5 ml 无菌去离子水（ddH2O）中，分装成 1 mL/ 份，-20 ℃保存。 5.2.24 50×TAE：称量 242.0 g Tris 溶于 700 mL 蒸馏水中，加入 57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）后定容至 1000 mL，使用时 50 倍稀释。 5.2.25 细胞裂解液：0.5 % SDS，0.5 % Triton X-100，10 mM Tris pH 7.6，10 mM Na2EDTA，8 mM MgCl2， 8mM NaCl。 5.2.26 DNA 分子量标准：DL 2000。 5.2.27 6×loading Buffer（市售）：含 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，30%甘油水溶液，4 ℃保 存。 6 仪器 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 2 PCR 仪。 紫外分光光度计。 电泳仪。 凝胶成像系统。 离心机：离心力≥12000 g。 微量可调移液器：0.2 μL～2 μL，2 μL～20 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1000 μL。 涡旋振荡器。 电子天平：感量 0.0001 g DB22/T 2260—2015 6.9 7 恒温水浴锅。 试样制备 新鲜、烘干或加工后鹿鞭样品，每个样品采集阴茎前段、中段及睾丸各选取2个点，每个点采集0.5 cm 的样品，在液氮下研磨成粉末状，放入冻存管中，-80 ℃保存。 3 8 8.1 分析步骤 提取 DNA 8.1.1 取处理后的试样约 50 mg，放入 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 细胞裂解液（5.2.25）摇匀， 加入 10 μL 蛋白酶 K，充分混匀后放入 55 ℃水浴中温和振荡，消化过夜。 8.1.2 加入等体积的 Tris 饱和酚，颠倒混匀离心，上清液转入新的离心管中，重复 2 次。 8.1.3 上清液加入等体积的酚和氯仿的混合液(1﹕1)，缓慢混匀 10 min，4 ℃ 12000 r/min 离心 5 min， 吸取上清。 8.1.4 上清液中加入等体积的氯仿，颠倒混匀，4 ℃ 12000 r/min 离心 5 min，吸取上清。 8.1.5 加入 2 倍体积的冰乙醇，混匀，4 ℃ 12000 r/min 离心 10 min，弃上清液。 8.1.6 加入 75%乙醇 500 μL，4 ℃ 12000 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀核酸。 8.1.7 在 65 ℃烘箱中干燥 5 min； 8.1.8 加入 100 μL 超纯水，溶解，-20 ℃保存。 注：也可用DNA提取试剂盒提取，按照试剂盒操作说明书指示进行操作。 8.2 PCR 检测 8.2.1 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1，同时设置阴性对照（无菌水）。 表1 PCR 反应体系 成分 用量/(μL) 10 × Buffer 2.5 dNTP/(2.5 mM) 3.0 上游引物/(10 μM) 0.5 下游引物/(10 μM) 0.5 Taq 酶/(5 U/μL) 0.5 DNA 模板 1.5 ddH2O 16.5 注：按照上述试剂顺序逐项加样至0.2 mL的PCR反应管中，混匀后瞬离。 8.2.2 PCR 反应程序 预变性95 °C，10 min；循环扩增94 ℃,1 min，56 ℃,50 s，72 ℃,1 min，30个循环；延伸72 ℃， 10 min。4 ℃保存。 3 DB22/T 2260—2015 8.2.3 扩增产物电泳 用1×TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5 μg/mL）。将平板放入水平电泳槽 中，加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6 μL与1 μL上样缓冲液混合，分别加入 样品孔中，取5 μL DNA Marker DL 2000加入到标准分子量对照孔内。5 V/cm恒压电泳30 min-45 min。 凝胶成像系统下观察并分析。 9 结果判定 若待检样品出现306 bp或307 bp特异性片段，即判定为梅花鹿或马鹿鹿鞭。 必要时取PCR扩增产物进行测序，如果结果与附录A参考序列比较，序列相似性在95 %以上，可进一 步确认待测样品结果为阳性。 10 废弃物处理和防止污染的措施 10.1 检测过程中的废弃物需经 121 ℃高压灭菌处理至少 30 min。 10.2 检测过程中防止交叉污染的措施见 WS/T 230-2002 中第六章规定执行污染的预防和控制规定。 4 DB22/T 2260—2015 AA 附 录 A （资料性附录） 梅花鹿、马鹿的特征性序列 A.1 梅花鹿特异扩增片段序列（307bp） ： ACAAAGCACGTGATATAACCTTATGTGTTTGTAGTACATAAAATTAATGCATTAAGGCACACATG TACAATGGTACATAAAATCGGTGTATAGGACATATTATGCATAATAGTACATAAATTAATGTATT AGGACATACTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATTTTCTAT TATCTACAGTACATAGTACATGATGTTGCTTATCGTACATAGCGCATTGAGTCAAATCAGTCCTC GTCAGCATGCGTATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTGATCACCATG A.2 马鹿特异扩增片段序列（306bp）： GCAAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAAATCAATGTACTAGGACATGCATG TATAACAGTACATAAGTTAGCGTATAGGACATATTATG