ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2521—2018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程 2018 - 07 - 23 发布 四川省质量技术监督局 2018 - 08 - 01 实施 发 布 1 DB51/T 2521—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 1 5 设备和器械 ........................................................................ 2 6 临床检查 .......................................................................... 2 7 实验室样品采集 .................................................................... 2 8 细菌分离与纯化 .................................................................... 2 9 细菌鉴定 .......................................................................... 2 10 结果判定 ......................................................................... 4 11 综合判定 ......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 试 剂 配 方 .................................................. 6 附录 B（资料性附录） 脑膜炎败血伊丽莎白菌 16S rRNA 基因参考序列（1450bp） ............ 9 I DB51/T 2521—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、陈德芳、郑李平、黄小丽、欧阳萍、白明焕、王世震。 II DB51/T 2521—2018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器械、临床检查、 实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于牛蛙(Rana catesdeiana)、美国青蛙(Rana grylio)、虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)、 黑斑蛙(Rana gotiath)、棘胸蛙(Rana spinosa)、林蛙(Rana sylvatica)等蛙类脑膜炎败血伊丽莎白菌 病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病 是指由脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)感染引起的蛙类发病或死亡的 一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基。 3.3 16S rRNA 16S ribosomal RNA 基因 16S核糖体RNA基因。 4 4.1 试剂和材料 试剂、染色液与培养基 1 DB51/T 2521—2018 2+ 按GB/T 4789.28、GB/T 18652与SC/T 7014规定执行。Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg ）、 DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录 A。 4.2 水 应符合GB/T 6682 中一级水的规格。 4.3 引物 16S rRNA基因DNA序列扩增引物，F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，R：5′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG AC-3′，-20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、 恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水 平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病蛙体色发黑，厌食懒动，运动机能失调，头部歪斜，游动失去平衡或浮于水面间隙性旋转。 6.2 外部检查 病蛙眼角膜发白，呈“白内障”表现，肛门红肿；四肢肿胀，后肢内侧充血、出血发红，腹部膨胀； 部分病蛙体表出现溃疡。 6.3 剖检 腹腔内大量淡黄色腹水，肝、脾、肾肿大，淤血、出血，胆囊扩张，胆汁充盈；肠道充血，肠腔无 食物，其内充滞多少不等的黏液。 7 实验室样品采集 样品采集按SC/T 7103 规定执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从病蛙的肝、肾中直接取样，按常规法划线接种脑心浸液琼脂培养基（Brain Heart Infusion, BHI）（A.1）。28℃培养36h～48h后，挑取表面光滑湿润、微隆起、质地较软、边缘整齐、 不透明、圆形的淡黄色优势菌落划线接种在BHI平板进行纯化培养。 9 细菌鉴定 2 DB51/T 2521—2018 9.1 革兰氏染色 按GB/T 4789.28中2.2的规定执行。 9.2 生理生化试验 9.2.1 精氨酸双水解酶试验 将待检菌穿刺接种在精氨酸双水解酶培养基（A. 2）上。28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红 色晕圈为阳性，无粉红色晕圈为阴性。 9.2.2 七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基平板（A.3）上，35℃培养24h。培养基变黑为阳性；不变为阴性。 9.2.3 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1％水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性； 不变色为阴性。 9.2.4 DNA 酶试验 将待检菌接种于DNA酶培养基平板（A.4）上，28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红色晕圈为阳 性；无晕圈为阴性。 9.2.5 过氧化氢酶（接触酶）试验 按SC/T 7014表2的接触酶试验的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。 9.2.6 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按SC/T 7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）试验的规定执行。培养基下层出现红色为阳性，不出现红 色为阴性。 9.2.7 甲基红（M·R）试验 按SC/T 7014表2的甲基红（M·R）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。 9.2.8 柠檬酸盐试验 按GB/T 4789.28中3.7的规定执行。培养基由绿色变为蓝色为阳性；不变蓝色为阴性。 9.2.9 吲哚试验 按SC/T 7014表2的吲哚试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。 9.2.10 鸟氨酸脱羧酶试验 按GB/T 4789.28中3.12的规定执行。培养基呈紫色为阳性，对照管培养基为黄色。 9.2.11 糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A. 5），28℃培养24h后观察。培养基变黄为阳性， 不变黄为阴性。 3 DB51/T 2521—2018 9.3 16S rRNA 基因 DNA 的序列测定和同源性分析 9.3.1 细菌基因组 DNA 提取 取2mL待检菌培养液，12000 r/min离心1min，收集菌体；菌体悬浮于500μL TE缓冲液（pH8.0）（A. 6），震荡悬浮，加入50μL 10％的SDS溶液（A. 7），10μL 20mg/mL的蛋白酶K（A. 8），混匀，37℃ 温育1h；加入100μL 5mol/L的NaCl溶液（A. 9），充分混匀，再加入100μL CTAB/NaCl溶液（A. 10） 混匀，65℃温育20min；加入等体积的酚﹕氯仿﹕异戊醇（25:24:1）（A. 11），混匀，12000 r/min 离心5min；取上清液加入等体积的氯仿﹕异戊醇（24:1）（A. 12），混匀，12000 r/min离心5min；取 上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000 r/min离心10min；沉淀用70％酒精 洗涤2次，室温晾干；加入50μL的TE缓冲液溶解，-20℃贮存，备用。 9.3.2 16S rRNA 基因 PCR 扩增 2+ PCR扩增体系：在PCR管中加入10×PCR缓冲液（无Mg ）5.0μL，MgCl2 （25mmol/L）5.0μL，dNTPs （10mmol/L）1.0μL，引物(20μmol/L) F和R各1.0μL，Taq DNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，无