ICS 65.020.20 B 15 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1036-2018 芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程 Techniquely Rules for Diagnosis and Detection of Sesame Bacterial Wilt[Ralstonia solanacearum Smith] 2018 - 07 - 03 发布 江西省质量技术监督局 2019 - 01 - 04 实施 发 布 DB36/T 1036-2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 症状诊断 .......................................................................... 1 4 病原菌形态学鉴定与致病性测定 ...................................................... 1 5 病原菌 PCR 检测 .................................................................... 2 附录 A（资料性附录） 培养基配制方法 .................................................. 3 附录 B（资料性附录） PCR 检测引物、反应体系条件 ...................................... 4 I DB36/T 1036-2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由江西省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院。 本标准主要起草人：华菊玲、李信申、黄小梅、刘清兰、熊艳、黄瑞荣、王希、史建苗、盛琦、饶 喜。 II DB36/T 1036-2018 芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程 1 范围 本标准规定了芝麻细菌性青枯病（Sesame bacterial wilt）诊断及检测技术的术语和定义、症状 诊断、病原菌形态学鉴定与致病性测定和病原菌PCR检测。 本标准适用于芝麻细菌性青枯病症状诊断、病原菌形态学鉴定及PCR检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 16s rRNA 序列 细菌染色体上编码 rRNA 相对应的 DNA 序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。具有高度的保 守性和特异性。16s rRNA 基因检测技术已成为病原细菌检测和鉴定的重要方法。 2.2 ITS 序列 16S～23S rRNA基因区间的一段高度可变序列，该区域种间多态性丰富，而种内却非常保守，这 些特点使得它在细菌分类鉴定研究上具有独特的优势。 3 症状诊断 初期在茎杆上出现暗绿色水浸状斑块，继而呈黑褐色条斑向上下扩展，顶梢常有2个～3个梭形溃疡 状裂缝，部分病茎溃疡状裂缝可延伸至茎杆中下部，溃疡状裂缝出现早而多的病株常呈畸形。病株顶端 先出现萎蔫，继而整株呈失水状，早期夜间可恢复正常，后期则呈黑褐色枯死。病株茎部维管束变褐色， 髓部空洞。折断茎杆常可见菌脓形成的透明细丝。茎杆表皮下常可见泡状隆起，刺破后有乳白色菌脓溢 出，渐成为漆黑色晶亮的颗粒。 4 病原菌形态学鉴定与致病性测定 4.1 菌株分离与形态学鉴定 4.1.1 菌株分离 采集典型的芝麻细菌性青枯病标本，剪取病健交界处病茎3cm～4cm，经75%酒精消毒、灭菌水冲洗 后，剪去两头取中间段置于装有5ml～10ml无菌水的试管中静置5min左右至悬浮液变混浊，用接种环蘸 1 DB36/T 1036-2018 取少量粗悬液分别在NA平板和TZC平板上划线或涂布。28℃培养72h后观察菌落形态。挑取典型菌落，进 行光学显微镜下菌体的革兰氏染色、鞭毛染色和形态观察。 4.1.2 形态学鉴定 根据以下形态学特征作为鉴定依据。青枯菌革兰氏染色反应为阴性，菌体杆状，具1根～4根极鞭， 无荚膜。在NA培养基平板上于28℃培养72h，见附录A，菌落呈污白色，平滑有光泽，呈粘液状，直径2mm～ 3mm。在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（简称TZC，下同）选择性培养基上，28℃培养72h，产生的菌落呈不 规则圆形，具流动性，中心呈红色至桔红色，边缘为白色，菌落直径2mm～5mm。 4.2 菌株致病性测定 4.2.1 接种体制备 8 将形态学鉴定为青枯菌(R. solanacerum)的菌株于NA平板上培养活化48h后，配成1×10 CFU/ml菌悬 液供接种备用。 4.2.2 接种期 芝麻初花期进行接种。用制备的菌悬液，回接芝麻健株，并以无菌水作为对照。 4.2.3 接种方法 在26℃～30℃温室保湿条件下，采用以下3种方法接种： ——剪叶接种：选择完全展开的叶片，用灭菌剪刀蘸取菌液剪叶； ——针刺接种：用灭菌的小号注射器抽取菌液，在茎杆中部叶腋处针刺注射菌液，每株注射菌液 0.1ml； ——伤根灌菌液接种:用小铁铲从距茎基 2cm～3cm 处斜插入土，随后每株灌入菌液 30ml。 4.2.4 结果调查 接种10d～14d后，观察接种植株是否产生典型症状。选取典型症状的植株，再次进行病菌分离和形 态学对比观察。从中选取典型菌株进行PCR检测。 5 病原菌 PCR 检测 5.1 特异性引物合成 16S rRNA 引物序列、16S～23S rRNA 基因区间 ITS 引物序列见附录 B。 5.2 PCR 扩增 以青枯菌标准菌株GMI 1000为阳性对照，以灭菌双纯水为阴性对照。取无菌条件下培养的待检测菌 株菌液少许为模板进行扩增。 5.3 琼脂糖凝胶电泳 取扩增样品5µl，加入1µl 6倍上样缓冲液（6×loading buffer），混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝 胶（含0.05µl/ml EB或Goldview）上样孔中，用0.5×TBE缓冲液在5V/cm～8V/cm电压条件下电泳30 min。 5.4 菌株 16SrRNA、ITS 序列测定与分析 2 DB36/T 1036-2018 对5.3获得的阳性克隆进行序列测定。将测定得到的各菌株16S rRNA序列、ITS序列与GenBank中核 酸数据进行BLAST对比分析，判定各待测菌株与标准模式菌株的同源性。 3 DB36/T 1036-2018 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基配制方法 A.1 NA培养基 牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖或蔗糖10g，琼脂18g～20g，蒸馏水1000ml， pH7.4～7.6。高压湿热121℃灭菌25min。 A.2 TZC培养基配制 ——1%TZC 溶液配制：称取 1g TZC，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，用过滤法灭菌，避光保存备用。 ——TZC 培养基制作：分别称取蛋白胨 2g，水解酪蛋白 0.2g，葡萄糖 2g，琼脂粉 4g。依次加入 200ml 蒸馏水中。加热溶化后，装入 250ml 三角瓶中，每瓶装 200ml。121℃高压湿热灭菌 25min 后，培养基冷却至 45℃左右时，于无菌条件下加入已灭菌的 1% TZC 溶液 0.5ml，摇匀 后倒入灭菌的培养皿中。 4 DB36/T 1036-2018 BB 附 录 B （资料性附录） PCR 检测引物、反应体系条件 B.1 PCR引物 B.1.1 16S引物序列分别为5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增片段大 小为1523 bp。 B.1.2 ITS引物序列为5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′；5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。扩增片段大小为591 bp。 B.2 PCR反应体系 25 µLPCR 反应体系： 试剂名称 用量 10×PCR 反应缓冲液（Buffer） 2.5 μL MgCl2(25 mmol·L-1) 2.0 μL dNTP(2.5 mmol·L-1) 2 μL 引物-F(20 μmol·L-1) 0.5 μL 引物-R(20 μmol·L-1) 0.5 μL Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1) 0.25 μL 模板（template） 0.5 μL ddH2O 16.75 μL total 25 μL B.3 PCR反应条件 5 DB36/T 1036-2018 反应条件为：95℃ 预变性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 7min。采用胶 回收法回收。 B.4 序列测定 PCR产物进行制备型琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带。选取阳性克隆进行序列测定。 _________________________________ 6