ICS 65.020.01 B 40 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3560—2019 荷斯坦牛致死单倍型（HH1、HH3、HH4 和 HH5） 基因检测技术规程 Code of practice for molecular detection of lethal haplotypes (HH1, HH3, HH4 and HH5) in Holstein 2019 - 05 - 29 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 06 - 29 实施 发 布 DB37/T 3560—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 检测原理 ........................................................................... 2 4.1 荷斯坦牛致死单倍型 HH1、HH3 和 HH4 的检测 ........................................ 2 4.2 荷斯坦牛致死单倍型 HH5 的检测 ................................................... 2 5 主要试剂 ........................................................................... 2 6 主要仪器设备 ....................................................................... 2 7 检测方法 ........................................................................... 2 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 样本采集 ....................................................................... DNA 提取 ........................................................................ DNA 浓度和纯度检测 .............................................................. 引物序列 ....................................................................... PCR 扩增 ........................................................................ PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 ...................................................... 测序分析 ....................................................................... 2 2 3 3 3 3 3 8 结果判定 ........................................................................... 3 8.1 8.2 8.3 8.4 致死单倍型 HH1 测序结果判定与表述 致死单倍型 HH3 测序结果判定与表述 致死单倍型 HH4 测序结果判定与表述 致死单倍型 HH5 扩增条带判定与表述 ............................................... ............................................... ............................................... ............................................... 3 4 4 5 9 废弃物的处理 ....................................................................... 5 10 检测过程中防止交叉污染的措施 ...................................................... 5 附 录 A （资料性附录） 主要试剂 .................................................... 6 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 ................................................ 7 附 录 C （规范性附录） PCR 扩增产物 ................................................. 9 I DB37/T 3560—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、威海市畜牧兽医局、山东奥 克斯畜牧种业有限公司、江苏省农业科学院畜牧研究所。 本标准主要起草人：黄金明、鞠志花、王秀革、张思聪、赵国清、高亚平、魏晓超、姜强、刘文浩、 张亚冉、李荣岭、李建斌、高运东、曲绪仙、侯明海、仲跻峰。 II DB37/T 3560—2019 荷斯坦牛致死单倍型（HH1、HH3、HH4 和 HH5）基因检测技术规程 1 范围 本标准规定了荷斯坦牛四种致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）的检测方法和结果判定。 本标准适用于荷斯坦牛四种致死单倍型（HH1、HH3、HH4和HH5）的检测与诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2—2004 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27642—2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 NY/T 1672—2008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 NY/T 2695—2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 DB37/T 2037—2012 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荷斯坦致死单倍型1 Holstein lethal haplotype 1，HH1 由牛第5号染色体的凋亡蛋白酶激活因子1（Apoptotic protease-activating factor 1，APAF1） 基因产生的终止突变（g.63150400C＞T；rs448942533；牛参考基因组UMD 3.1）引起的一种隐性遗传缺 陷。当突变等位基因纯合时，个体致死，大多数表现为妊娠早期流产，不易被观察，在健康奶牛群体中 无纯合的HH1单倍型。 3.2 荷斯坦致死单倍型3 Holstein lethal haplotype 3，HH3 由牛第8号染色体的染色体结构维持2（Structural maintenance of chromosomes 2，SMC2）基因 一个错义突变（g.95410507T＞C；rs456206907；牛参考基因组UMD 3.1）引起的一种隐形遗传缺陷，与 乳蛋白、繁殖年限、青年牛受胎率、母牛受胎率有关,当突变的等位基因纯合时致死。 3.3 荷斯坦致死单倍型4 Holstein lethal haplotype 4，HH4 1 DB37/T 3560—2019 由牛1号染色体的磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶（Phosphoribosylglycinamide formyltransferase, GART）基因的一个错义突变（g.1277227A＞C；rs465495560；牛参考基因组UMD 3.1）引起的隐性遗传 缺陷。HH4导致流产，与产奶、乳蛋白和繁殖力有关，无纯合子个体。 3.4 荷斯坦致死单倍型5 Holstein lethal haplotype 5，HH5 由牛9号染色体的线粒体转录因子B1（Transcription factor B1, mitochondrial, TFB1M）基因缺 失138.348 kb的区域（93232651 bp至93370998 bp；牛参考基因组UMD 3.1）造成的一种隐性遗传缺陷， 携带者影响乳蛋白量和女儿妊娠率，无纯合子个体。 4 检测原理 4.1 荷斯坦牛致死单倍型 HH1、HH3 和 HH4 的检测 根据牛APAF1、SMC2和GART基因的因果突变设计特异引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序分析， 根据DNA测序的峰图及碱基序列比对结果，判断其基因型，确认是否携带致死单倍型。 4.2 荷斯坦牛致死单倍型 HH5 的检测 根据牛TFB1M基因的缺失序列，首先在牛TFB1M基因缺失序列中设计一对引物，进行PCR扩增，携带 者与正常者均可扩增出目的条带。其次在牛TFB1M基因缺失序列两端设计一对引物，进行PCR扩增，携带 者可扩增出目的条带，正常者因扩增片段太长，检测时无条带。最后根据两对引物的PCR扩增产物电泳 条带，对致死单倍型HH5携带者和正常者综合进行判断。 5 主要试剂 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121 ℃， 1.034×105 Pa压力，蒸汽灭菌20 min。主要试剂见附录A。 6 主要仪器设备 见附录B。 7 检测方法 7.1 样本采集 颈静