ICS 13.060 Z 16 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3632—2019 渔业用水中多西环素、四环素、土霉素、金 霉素残留量的测定 高效液相色谱法 Determination of doxycycline, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline， residues in fishery water by high performance liquid chromatography (HPLC) 2019 - 07 - 23 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 08 - 23 实施 发 布 DB37/T 3632—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 原理 ............................................................................... 1 4 试剂与配制 ......................................................................... 1 5 仪器和设备 ......................................................................... 2 6 试样的测定 ......................................................................... 2 6.1 6.2 6.3 6.4 样品的制备 ..................................................................... 样品的提取净化 ................................................................. 标准曲线的制备 ................................................................. 测定 ........................................................................... 2 2 2 2 7 计算 ............................................................................... 3 8 检测限 ............................................................................. 3 9 回收率 ............................................................................. 3 10 精密度 ............................................................................ 4 附 录 A （资料性附录） 色谱图 ...................................................... 5 I DB37/T 3632—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC 03)归口。 本标准起草单位：济宁市渔业监测站。 本标准主要起草人：史艳伟、孟丽华、时彦民、刘方、吴广州、蒋帮铜、孟娟、邓晨曦、简康、时 兵。 II DB37/T 3632—2019 渔业用水中多西环素、四环素、土霉素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本 标 准 规 定 了 渔 业 用 水 中 土 霉 素 (Oxytetracycline) 、 四 环 素 （ Tetracycline ） 、 金 霉 素 (Chlortetracycline)、多西环素（Doxycycline，Vibramycin又名强力霉素、脱氧土霉素）残留量的测 定原理、试剂与配制、仪器和设备、试样的测定、计算、检测限、回收率与精密度等。 本标准适用于渔业用水中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 水样经HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪配紫外检测器测定，外标法定量。 4 试剂与配制 所用试剂除另有规定外，均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682一级水标准。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 磷酸：色谱纯。 4.4 磷酸二氢钠。 4.5 0.01 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠 1.56 g，用 950 mL 水溶解，磷酸调 pH 至 2.5，用 水稀释并定容至 1 000 mL，过 0.45 μ m 水相滤膜备用。 4.6 土霉素标准品：（CAS：2058-46-0）纯度≥96.0 %。 4.7 四环素标准品：（CAS：64-75-5）纯度≥94.0 %。 4.8 金霉素标准品：（CAS：64-72-2）纯度≥99.0 %。 4.9 多西环素标准品：（CAS：24390-14-5）纯度≥98.0 %。 4.10 土霉素、四环素、金霉素、多西环素标准储备液：分别准确称取土霉素标准品 0.010 0 g，四环 素标准品 0.010 0 g，多西环素标准品 0.010 0 g，金霉素标准品 0.020 0 g，用甲醇溶解并定容至 100 mL，制得土霉素、四环素、多西环素浓度分别为 100 μ g/mL，金霉素浓度为 200 μ g/mL 的标准储备液， -18 ℃避光保存，有效期 6 个月。 1 DB37/T 3632—2019 4.11 土霉素、四环素、金霉素、多西环素混合标准使用液：分别移取 4.10 中的标准储备液 10.0 mL， 定容至 100 mL，制得土霉素、四环素、多西环素浓度为 10 μ g/mL，金霉素浓度为 20 μ g/mL 的混合标 准使用液，0 ℃～4 ℃避光保存，有效期 2 周。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 液相色谱仪，配紫外检测器。 氮吹仪。 超声波清洗器。 超纯水仪。 涡旋混合器。 分析天平：感量 0.000 1 g。 HLB 固相萃取柱：60 mg，3 mL，或性能相当者。 抽滤装置。 6 试样的测定 6.1 样品的制备 水样经0.45 μ m滤膜过滤，备用。 6.2 样品的提取净化 固相萃取小柱预先用3 mL甲醇、3 mL水活化，准确量取60 mL经过滤后的水样（6.1），转移至固相 萃取柱中，控制流速不超过2 mL/min，用5 mL水淋洗小柱，抽干，用8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL 具塞玻璃离心管中，于40 ℃下氮气吹干，残留物用1.0 mL流动相溶解定容，涡旋混合1 min，超声2 min， 过0.45 μ m滤膜，供液相色谱测定。 6.3 标准曲线的制备 分别准确移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL混合标准使用液（4.11），用流动相定 容至100 mL，制得一系列浓度的混合标准工作液，使其中土霉素、四环素、多西环素浓度系列为0.05、 0.10、0.20、0.50、1.0 μ g/mL；金霉素标准使用浓度系列为0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 μ g/mL。 此标准使用液现配现用。以峰面积为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。 6.4 测定 6.4.1 色谱参考条件 6.4.1.1 6.4.1.2 6.4.1.3 6.4.1.4 6.4.1.5 6.4.1.6 6.4.1.7 色谱柱：XDB-C18 柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μ m；或者性能相当者。 流动相：A：乙腈；B：0.01 mol/L 磷酸二氢钠溶液（4.5）。 流速：1.0 mL/min。 进样量：50 μ L。 波长：350 nm。 柱温：30 ℃。 流动相梯度洗脱程序见表 1。 2 DB37/T 3632—2019 表1 流动相梯度洗脱程序 时间（min） A（%） B（%） 0 17.0 83.0 15 32.0 68.0 16 45.0 55.0 17 45.0 55.0 18 17.0 83.0 25 17.0 83.0 6.4.2 液相色谱测定 在上述色谱条件下对标准工作液和样品溶液分别进行测定，土霉素、四环素、金霉素、多西环素保 留时间分别为6.2 min、7.5 min、12.1 min、13.5 min。标准工作液和样品溶液中土霉素、四环素、金 霉素、多西环素响应值均应在仪器检测线性范围内。液相色谱图参见附录A（图A.1、图A.2）。 6.4.3 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。液相色谱图参见附录A（图A.3）。 7 计算 试样中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量按公式计算。计算结果需扣除空白值，结果保留 3位有效数字。 X  C V ....................................... (1) V0 式中： X ——样品中各抗生素含量，单位为毫克每升（mg/L）； C ——样品溶液中各抗生素含量，单位为微克每毫升（µg/mL）； V ——样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）； V0 ——样品溶液量取体积，单位为毫升（mL）。 8 检测限 本方法土霉素、四环素、多西环素检出限为5 μ g/L