ICS  65.020 B 20 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2905—2017 辣椒疫霉菌检测鉴定方法 Method for detection and identification of Phytophthora capsici 文稿版次选择 2017 - 06 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 07 - 30 实施 发 布 DB34/T 2905—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1 - 2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、霍山县百草林石斛发展有 限公司、寿县农业技术推广中心、宿州市植检植保站、安徽农业大学植保学院、徽州区西溪南镇政务中 心、霍山县农业技术推广中心、鸠江区农业技术推广中心、铜陵农业循环经济试验区农技站。 本标准起草人：戚仁德、赵伟、迟元凯、戚士胜、马书芳、潘月敏、张建喜、吴军、汪涛、朱德慧、 陈晴晴、刘浪、郑仁兵、唐文、刘继荣、汪海洋、李汪洋。 I DB34/T 2905—2017 辣椒疫霉菌检测鉴定方法 1 范围 本标准规定了辣椒疫霉的分离、形态学和 PCR 检测鉴定方法。 本标准适用于辣椒、南瓜、西葫芦、西瓜、甜瓜等疑似病株上辣椒疫霉的检测鉴定。 2 鉴定依据 以辣椒疫霉引致病害的症状、病菌形态学特征、PCR 反应结果等为鉴定依据。辣椒疫霉的形态学特 征及其所引致病害的症状参见附录 A。 3 培养材料准备 3.1 培养基准备 3.1.1 基础培养基 基础培养基可选胡萝卜培养基、燕麦培养基、V8 培养基等中的一种。 ——胡萝卜培养基：  将 200 g 新鲜的胡萝卜切成小片，加去离子水 500 mL，捣碎后用 4 层纱布过滤去渣， 补水至 1000 mL，加琼脂粉 20 g，煮沸待琼脂熔化后分装，在 121℃ 下高压蒸汽灭菌 20 min，冷却后备用。 ——燕麦培养基：  称取燕麦片 30 g, 加水 1000 mL，在 60 ℃ 下水浴 1 h，双层纱布过滤去渣。上清液补 水至 1000 mL，加入琼脂 20 g，煮沸待琼脂熔化后分装，在 121℃ 下高压蒸汽灭菌 20 min， 冷却后备用。 —— V8 培养基：  量取 100 mL V8 汁，加去离子水 900 mL、CaCO3 0.2 g、琼脂 20 g，在 121 ℃ 下高压 蒸汽灭菌 20 min，冷却后备用。 ——液体培养基：  将上述某一种基础培养基与去离子水按 1:9 比例稀释，在 121℃ 下高压蒸汽灭菌 20 min，冷却后备用。 3.1.2 选择性培养基 将某一种基础培养基冷却至 50℃～60℃时，按每升培养基需青霉素 50 mg、五氯硝基苯 50 mg、 多菌灵 5 mg 和利福平 100 mg 的比例加入，摇匀后备用。 3.2 对照菌株 辣椒疫霉 (Phytophthora capsici Leonian) 菌株。 1 DB34/T 2905—2017 4 分离、纯化与孢子囊诱导 4.1 分离与纯化 将新鲜病组织表面用自来水冲洗干净，稍凉干，从病健交接部位将病组织切成约 2 mm×2 mm 的小 块，沿培养皿周缘直接置于选择性培养基平板上，在培养箱中 25℃ ～ 28℃条件下培养 2 d ～ 3 d，待 菌落形成后，将培养皿底朝上置于低倍显微镜下观察，若分离物的菌丝无隔膜，则从菌落边缘挑取少量 的菌丝，转接至不含任何药剂的基础培养基上，在同样温度条件下培养 3 d 后，从菌落边缘切取菌丝 块分别转接到新的基础培养基平板上和回接到健康的同种作物的相同部位，选取导致与田间症状相同的 分离物进行后面的操作。 4.2 孢子囊诱导 将在基础培养基平板上生长 5 d 左右的菌落切成大小约为 10 mm×10 mm 的菌丝块，移入灭菌后 的空白培养皿中，将菌丝块的菌丝面朝上，再缓慢加入灭菌水，让水刚刚淹过菌丝面，再将培养皿置于 日光灯下连续照光约 48 h。 5 形态学鉴定 观察培养 4 d 左右的菌落形态，并沿菌落边缘挑取少量菌丝，置于显微镜下观察菌丝的形态：如 颜色、是否有隔膜、分枝情况等，与对照菌株和附录 A 描述的形态进行比对。再挑取经 4.2 处理的菌 丝，置于显微镜下，观察是否产生了孢子囊和藏卵器。挑取产生了大量孢子囊的菌丝丛，放入小试管内， 加入 0.5 mL～1 mL 灭菌水，将试管底部撞击手心 10 余次，使孢子囊因震荡而脱落，吸取 1 滴孢子 囊悬浮液，在显微镜下观察孢子囊及孢囊梗的形态、大小，乳突的有无，测量乳突厚度、孢子囊柄长度 等，与对照菌株和附录 A 描述的形态进行比对、判断。 6 回接实验 选取与取样作物相同品种的健康植株或组织 5 株（个），先在接种部位用接种针扎几个小孔，再 3 切取经纯培养的分离物菌丝块回接到创伤部位，也可用浓度为 5×10 个/mL 的游动孢子悬浮液接种， 接种后均需用浸水棉球保湿 2 d～3 d，在 25℃～28℃的条件下培养 5 d 左右，观测是否发病、病害 症状是否属典型的疫病症状或与最初分离时的症状相似。 接种发病后，再从病健交界处重新按 4.1 进行分离培养，观测其形态学性状与接种物是否相同。 7 PCR 检测 7.1 病原菌基因组 DNA 的提取 7.1.1 分离培养物 DNA 的提取 将纯培养的分离物在基础液体培养基中培养 10 d 左右，抽滤收获菌丝体，用无菌水冲洗 1 次～2 次，并用无菌吸水纸吸去多余水分。将获得菌丝移于灭菌研钵内，加液氮研磨至粉末状后转移到 1.5 mL 的离心管中。 用 DNA 提取试剂盒或提取试剂按 CTAB 法提取菌丝 DNA，CTAB 法参见附录 B。 7.1.2 2 病样 DNA 的提取 DB34/T 2905—2017 切取约 2 mm×2 mm 的发病组织，放入 10 µL 新配的 0.5 M 的 NaOH 溶液，碾磨，再以 12000 ×g 转速离心 5 min，移出 5 µL 上清液后立即用 195 µL 的 100 mM Tris 缓冲液（pH=8.0）稀释。 样本可立即进行 PCR 反应 (每 25 µL 反应液用 1 µL)，或置于 −20℃下备用。 7.2 PCR 检测鉴定 以 5’-GTCTTGTACCCTATCATGGCG-3’ 和 5’-CGCCACAGCAGGAAAAGCATT-3’ 为特异性引物，每 25 μL PCR 反应体系包括 1 µL 基因组 DNA，0.5 µM 引物，50 µM dNTP，2.5 µL 10 × PCR 反应缓冲液（100 2+ mM Tris-HCl pH 8.3，500 mM KCl，15 mM MgCl2），2 mM/L Mg ，2.5 µL 1％的牛血清蛋白，0.25 µL 吐 温-20 和 1.25 U TaqDNA 酶，用灭菌超纯水定量到 25 μL。 热循环反应参数为：94℃ 预变性 5 min， 然后经 94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循 环；最后 72℃延伸 7 min。 反应结束后取 PCR 扩增产物 5 μL 上样于 1％琼脂糖凝胶电泳检测。 8 结果判定 经形态学观测，与对照菌株和附录 A 描述的形态相似的分离物可初步确诊为辣椒疫霉；经 PCR 扩 增，能扩增出与对照菌株相同的 560 bp 单一明亮条带的，可最终判定为辣椒疫霉。 3 DB34/T 2905—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 辣椒疫霉形态描述及其引致病害的典型症状 A.1 辣椒疫霉形态 辣椒疫霉在固体培养基上菌落呈放射状、絮状，气生菌丝中等到旺盛。 菌丝形态简单，无隔、多核、多分枝，粗 3 μm～10 μm。孢囊梗不规则分枝或伞形分枝，细长， 粗 1.5 μm～3.5 μm。 孢子囊形状、大小变化较大，从近球形、卵形、肾形、梨形到长卵形、椭圆形和不规则形，（21 μm～ 51 μm）×（22 μm～34 μm），长宽比值为 1.5～2.2；具明显乳突 1 个，偶有 2 个，乳突明显，厚度 ≥5 μm，但也有部分孢子囊乳突较薄；孢子囊基部圆形或渐尖；孢子囊脱落后具长柄，柄长 17 μm～61 μm，平均长度＞20 μm；孢子囊成熟后直接萌发或释放游动孢子，球形或不规则形，顶生或间生，直径 18 μm～28 μm。 异宗配合，配对培养易产生大量球形藏卵器，直径 20 μm～31 μm，平均 26.1 μm，壁光滑，柄多 为棍棒状，少数为圆锥形。雄器球形或圆筒形，围生，无色，（10 μm～20 μm）×（9 μm～14 μm）。 卵孢子球形，直径 16 μm～26 μm。 其鉴别特征为：乳突明显，脱落孢子囊具长柄（平均长度＞20 μm），异宗配合。 A.2 辣椒疫霉所致病害典型症状 A.2.1 茎基部症状 茎基部染病后初呈水浸状，后逐渐变褐、凹陷，有的湿腐，苗期最后常致猝倒或立枯状死亡，成株 期发病后，茎基部常由水浸状变为黑褐色凹陷的连片病斑，并导致植株死亡。 A.2.2 根部症状 根部染病后常变褐、腐烂，亦常伴有茎基部症状。 A.2.3 茎、叶部症状 茎、叶片染病后，常产生暗绿色病斑，叶片软腐脱落，茎由暗绿色水浸状病斑逐渐变为黑褐色，引 起湿腐或茎枝倒折，湿度大时病部均可见霜状白霉至白色絮状菌丝层。 A.2.4 花、果部症状 花蕾染病后迅速变褐脱落；果实发病，多从蒂部或果缝处开始，初为暗绿色水渍状不规则形病斑， 很快扩展至整个果实，呈灰绿色，果肉软腐，湿度大时病部常见霜状白霉至白色絮状菌丝层。 4 DB34/T 2905—2017 BB 附 录 B （资料性附录） CTAB 法从纯化的菌丝体中提取 DNA 1. 将菌丝进行低温冷冻干燥处理（﹥24 h）， 保存在 -20℃待用； 2. 取 0.1 g～0.2 g 菌丝于 1.5 mL～2 mL 的离心管中，用玻璃棒将干燥后的菌丝充分碾碎； 3. 加入 0.6 mL～1 mL CTAB 提取缓冲液，充分振荡之后置 70℃水浴中静置 30 min； 4. 15000 ×g 高速离心 10 min，吸取上清液至在 1.5 mL 离心管中； 5. 在上清液中加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合 30 sec，14000 ×g 离心10 min。 6. 收集上清液，加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠和 2 倍体积的冰冻 100％乙醇，小心混匀； 7. 混合液置 -20℃低温下 1 h 以沉淀 DNA； 8. 15000 ×g