ICS 65.020.20 CCS B 05 DB2301 黑 龙 江 省 哈 尔 滨 市 地 方 标 准 DB 2301/T 93—2021 高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程 2021 - 11 - 19 发布 2021 - 12 - 19 实施 哈尔滨市市场监督管理局 发 布 前 言 本文件依据GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心提出。 本文件由哈尔滨市农业农村局归口。 本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心、哈尔滨市农业技术推广总 站、黑龙省农业科学院和东北农业大学。 本文件主要起草人：严君、王崇生、陆欣春、许艳丽、邹文秀、陈旭、姚玉波、潘凤娟、居瀚寻。 I 高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程 1 范围 本文件规定了高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程的术语和定义、大豆根瘤菌获得、大豆盆栽根瘤菌 复筛、高效大豆根瘤菌田间验证和档案管理。 本文件适用于哈尔滨市田间高效大豆根瘤菌菌株筛选。 2 规范性引用文件 列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 15618 土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准（试行） GB 20287 农用微生物菌剂 NY 410 根瘤菌肥料 NY/T 1536 微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南 NY/T 1735 根瘤菌生产菌株质量评价技术规范 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 高效大豆根瘤菌 存活能力强、具有高效固氮能力、竞争结瘤能力，接种后使大豆显著增产的大豆根瘤菌菌株。 4 大豆根瘤菌获得 4.1 大豆品种选择 选择当地主导大豆品种。 4.2 大豆根瘤采集 在大豆盛花期时，选取叶色浓绿、生长旺盛的大豆植株，将大豆根系挖出带回实验室，用清水冲干 净后，选取 4 至 6 个新鲜的颗粒饱满、深红色的大根瘤（带部分根）从根部分离。 4.3 大豆根瘤菌菌株分离与纯化 1 将采集的根瘤用 0.1 % 升汞溶液表面灭菌 3 min，无菌水冲洗 8 次~ 10 次。在无菌条件下，用镊子将 根瘤压碎，挤出汁液涂布在根瘤菌琼脂培养基上，26℃~28℃暗培养，快生菌培养 3 d~ 4 d，慢生菌培养 5 d ~ 7 d，将长出的单菌落采用划线培养法分离。根瘤菌琼脂培养基配方应符合 NY 410 中的规定。 4.4 大豆根瘤菌菌株确定 肉眼观察菌落一致、无杂菌后再纯化 1 次~ 2 次，即获得纯菌株。根据获得菌株的菌体和菌落特征， 可初步确定为大豆根瘤菌，菌体和菌落特征应符合 NY 410 中的规定。将纯菌株在无菌条件下接种于根 瘤菌液体培养基中，在 180 r∙min-1 和 28 ℃ 的恒温摇床中培养至对数生长期，并将供试菌株的菌液在 600 nm 的 OD 值均调至 0.8 时作为接种菌液。 大豆接种验证：选择当地主导大豆品种。大豆种子表面消毒后催芽，种芽长 1 mm ~ 2 mm 时用纯菌株 接种液浸泡 1 min ~ 2 min，然后移植到试管根瘤菌琼脂斜面上。设不接种的阴性对照和接种已知菌的阳 性对照，每个处理重复≥ 3 次，在 20 ℃~25 ℃下培养，光强 7 000 lx ~ 8 000 lx，每天光照时间 12 h~ 13 h。 10 d~20 d后观察大豆结瘤情况。如不接种的阴性对照结瘤，试验需要重做。空白对照不结瘤，可以判定 -5 试验没有污染，在 10 稀释度中 70 % 植株结有效瘤，用刀片将根瘤切开，若根瘤内部为粉红色、红色或 褐色为有效根瘤，白色或绿色为无效根瘤，即确定接种菌为大豆根瘤菌菌株。 4.5 大豆根瘤菌菌株保存 大豆根瘤菌菌株保存，应该符合 SN/T 2632 中的规定。 5 大豆盆栽根瘤菌复筛 5.1 试验准备 蛭石采用间歇性高压湿热灭菌 2 次，每次 121 ℃ 1 h，然后置于阴凉通风处 2 d ~3 d。盆钵用 5 % 次氯 酸钠或 0.1 % 高锰酸钾溶液消毒，并用无菌水冲洗，将灭菌蛭石装入盆钵中，浇适量无菌水备用。选择 -9 当地主导大豆品种。将 4.2 中确定的大豆根瘤菌菌株，制备成菌体数量≥ 1.0 × 10 cfu/mL 的接种液， 接种液制备应执行 NY/T 1735 的规定。 5.2 盆栽实施和管理 选择当地主导大豆品种。设置空白接种：将已表面灭菌的大豆种子播于灭菌后蛭石中。大豆接种验 证（待测根瘤菌接种）：将已表面灭菌的大豆种子在待测根瘤菌接种液中浸泡 1 min ~2 min，移植到灭菌 后的蛭石中。然后在 20 ℃~25 ℃下培养，光强 7 000 lx ~8 000 lx，每天光照时间 12 h~ 13 h。每盆定植 1 株 ~2 株大豆，不施肥或只施无氮营养液。 5.3 大豆根瘤菌与大豆品种的共生匹配性和固氮能力检测 在大豆初花期，将植株连根取出后用清水洗净，观察根系结瘤情况和根瘤菌的有效性。不接种处理 应不结瘤，若结瘤须重新进行盆栽实验。植株样品在 105 ℃下杀青 5 min ~ 10 min，再在 80 ℃下烘至恒重， 测定每盆植株干重和含氮量，并计算植株总含氮量和待测接种菌株处理较不接种处理植株总氮量的增加 量。植株含氮量测定及其增加量的计算应执行 NY/T 1735 中的规定。接种待测菌株处理与不接种处理相 比，收获大豆植株总氮量增加 ≥ 20 %，统计检验达到显著水平，确定该待测菌为高效大豆根瘤菌。 6 高效大豆根瘤菌田间验证 2 6.1 试验设计 2 试验处理：不接种根瘤菌、接种参比菌株、接种待测根瘤菌菌株。小区面积 ≥ 30 m ，每个处理 ≥ 3 个重复，小区采用长方形，种植在 ≥ 2 个不同土壤肥力地区，随机排列，试验设计应符合 NY/T 1536 的 规定。 6.2 试验准备 6.2.1 试验地准备 试验地选择应具有代表性，地势平坦，土壤肥力均匀，前茬作物一致，浇排水条件良好，土壤肥力 应为中低水平。试验田应避开道路、堆肥场所、水沟、水塘、高大建筑物及树木遮阴等特殊地块，应符 合 NY/T 1536 的规定。土壤环境质量应符合 GB 15618 规定，空气环境质量应符合 GB 3095 的规定。整地、 设置保护行、试验地区划（小区、重复间尽量保持一致）；小区单灌单排；测定土壤的有机质、全氮、 速效磷、速效钾、pH等基本理化性质。 6.2.2 根瘤菌菌株接种液准备 按照试验设计准备所需要的根瘤菌接种液，菌液质量应符合 GB 20287 中的规定。 6.2.3 大豆品种准备 选择当地主导大豆品种。 6.3 田间试验实施和管理 6.3.1 施肥措施 按照常规施磷肥和钾肥。根据土壤的含氮量可适当施用少量氮肥。 6.3.2 田间管理 符合 NY/T 1536 的规定。 6.4 测产及评价 大豆收获期，每个小区单打、单收、单计产或取代表样方测产。计算接种待测根瘤菌菌株处理与不 接种处理产量相比，籽粒产量增加 ≥ 10 %，统计检验达到显著水平；接种待测根瘤菌菌株处理与接种参 比菌株处理相比，籽粒产量增加 ≥ 5 %，统计检验达到显著水平，即可确定该待测菌为高效大豆根瘤菌。 高效大豆根瘤菌的评价要求应符合 NY/T 1735 中的规定。 7 档案管理 建立档案，内容包括：大豆根瘤菌获得、盆栽根瘤菌复筛、高效大豆根瘤菌田间验证（试验设计、 试验准备、田间试验实施和管理、测产及评价）。 3