ICS 65.020.20 CCS B 31 34 安徽省地方标准 DB34/T 4487 —2023 水禽坦布苏病毒和星状病毒双重 PCR检测 技术规程 Technical regulation for do uble PCR detection method of waterfowl Tembusu virus and Astrovirus 2023 - 07 - 31 发布 2023 - 08 - 31 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 4487 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽农业大学提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、滁州市动物疫病预防与控制中 心、定远县畜牧兽医局、合肥华盟生物技术有限公司、安徽省皖西白鹅原种场有限公司。 本文件主要起草人：王桂军、朱良强、许青华、李文来、郑举、范亚楠、何长生、解新迪、张云凯、 段倩倩、伍唯、张新。 DB34/T 4487 —2023 1 水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了水禽坦布苏病毒和星状病毒双重 PCR 检测方法的主要仪器设备、试剂、引物与标准 品、操作步骤、结果判定、生物安全管理及废弃物处理。 本文件适用于水禽坦布苏病毒和星状病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 坦布苏病毒 Tembusu virus 坦布苏病毒(Tembusu virus,DTMUV)属于黄病毒科(Fl auiviri dae)、黄病毒 属(Flaoivirus )。 坦苏病毒病(Tembusu virus disease):是由坦布苏病毒引起的鸭的一种传染病，感染该病的种鸭 通常会引起严重的产蛋率下隆、共济失调，卵巢出血、发炎的现象。 星状病毒 Astrovirus 星状病毒(Astroviruses, AstV)是一 种圆形、无囊膜、单股正链 RNA 病毒，其直径为 25～35 nm。 因在电子显微镜下，病毒表面有 5～6 个突起，结构呈星形，故称之为星状病毒。 星状病毒病，一种由星状病毒引起以内脏和关节痛风为主要症状的传染性疾病，可引起雏鹅腹泻性 肠炎、肾炎及尿酸盐沉积等症状，是引发雏鹅痛风的重要原因之一。 4 主要仪器设备 PCR 扩增仪。 台式低温高速离心机：最大离心力 17000 g 以上。 电泳仪：电压 10-300 V,电流 4-400 mA,功率最大75 W。 凝胶成像系统：紫外透射面积 20 ×20-21 ×26 cm,波长 302 nm。 DB34/T 4487 —2023 2 冰箱：-20℃；-80℃。 微波炉。 分析天平：精确度 0.001 g。 水浴锅。 微量移液器：2.5 µL、10 µL、20 µL、200 µL、1000 µL。 超净工作台。 5 试剂 RNA 抽提试剂：Trizol 或其他商品化 RNA 提取试剂。 氯仿、异丙醇、无水乙醇：为分析纯。 Reaction Buffer (5×)， d NTP Mix，反转录酶，TaqDNA 聚合酶， RNase Inhibitor (20 U/µL)、 Random Hexamer primer。 1×TAE 电泳缓冲液：配制方法见附录 A。 0.1M pH 7.4 PBS：配制方法见附录 A。 DNA 分子标准 1％琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A。 灭菌超纯水：符合 GB/T 6682 的规定，121℃、20 min，高压蒸汽灭菌。 ddH2O：双重蒸馏水。 6 引物与标准品 扩增星状病毒（GAsTV）的引物，扩增 DNA 片段大小为 300 bp。 —— 上游引物 ： 5'- AGA AGG TGC GGA AG A GTG GT A TGA-3' —— 下游引物 ： 5'- GCG AAG AGT GCG TAA GAG GTT GT-3' 扩增坦布苏病毒（DTMUV）的引物，扩增 DNA 片段大小为 404 bp。 —— 上游引物 ： 5'- CTG ATG GCT TTG GT C CTG TTC-3' —— 下游引物 ： 5'- ACA CCT ATT CTC AC C ACA TC T AAC-3' 阴性对照品：灭菌超纯水。 阳性对照品：坦布苏病毒 cDNA 和星状病毒 cDNA。 7 操作步骤 样品的采集与处理 7.1.1 样品采集 应按照 NY/T 541 的规定执行，无菌采集感染或病死禽类各种组织与器官（肝脏、脾脏、肾脏）。 7.1.2 样品处理 取待检组织样品适量（1 g)，按 1:5 倍（W/W)加入无菌 0.1M pH 7.4 PBS，于灭菌并烘干的研钵 或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融 3 次后，4℃ 8000 rpm/min 离心 20 min，取上清 1 mL 转至无 菌的 1.5 mL 离心管中，编号备用。 DB34/T 4487 —2023 3 RNA 提取 7.2.1 用 Trizol 或其他商品化 RNA 提取试剂提取待测样品。 7.2.2 200 µL 样品和 1 mL Trizol 加入EP 管中，4℃裂解 10～20 min,轻轻颠倒混匀。 7.2.3 加入 200 µL 氯仿，上下颠倒混匀，静置 5 min；12000 rpm 4℃离心 15 min，吸取上清于新 的 EP 管中。 7.2.4 加入 750 µL 异丙醇，混匀静置 10 min；12000 rpm 4℃离心 10 min，吸弃上清，留下沉淀。 7.2.5 加入无水乙醇 1 mL，轻轻颠倒，洗涤管壁；12000 rp m 4℃离心 10 min小心吸弃上清。 7.2.6 打开 EP 管管盖，室温干燥 2～3 min，干燥后加入适量 ddH 2O，-80℃保存备用。 反转录（cDNA 合成） 7.3.1 在 PCR 反应管中分别加入 11 µLRNA模板，4.0 µL Reaction Buffer(5 ×)，2.0 µL d NTP Mix， 1.0 µL 反转录酶，1.0 µL RNase Inhibitor (20 U/ µL)、1.0 µL Random Hexamer primer。 7.3.2 于 PCR 扩增仪，反应条件为 25℃ 10 min，42℃ 1 h，反应后，转录产物置 -20℃保存备用。 PCR 反应 7.4.1 PCR 反应体系 总体积为 20 µL ，2 ×Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) 10 µL，DTMUV 和 GAsTV上游引物各 0.5 µL，DTMUV 和 GAsTV下游引物各 0.5 uL， 反转录产物 2 µL 添加 ddH 2O 至 20 µL。 7.4.2 PCR 反应条件 预变性 95℃ 3 min，变性 95℃ 15 s，退火 52℃ 20 s，延伸 72℃ 15 s，循环 30 次，延伸 72℃ 5 min。每次 PCR 均应设阳性对照和阴性对照。 电泳 7.5.1 制备 1.0％琼脂糖凝胶板。 7.5.2 取 5 µL PCR 产物，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中 。 7.5.3 加入分子量标准。 7.5.4 盖好电泳仪，插好电极，将电压调至 90V 左右，电泳 30～40 min。 7.5.5 用紫外凝胶成像仪观察，用分子量标准比较，判断 PCR 片段大小。 8 结果判定 在阳性对照出现 300 bp，404 bp 大小的扩增条带、阴性对照无目的条带出现的情况下判定结果 （见附录 B）。 结果同时出现大小约 300 bp和 404 bp 扩增片段时，判定坦布苏病毒和星状病毒为阳性。 结果出现大小约 300 bp扩增片段时，判定为星状病毒阳性。 结果出现大小约 404 bp扩增片段时，判定为坦布苏病毒阳性。 未出现大小约 300 bp或 404 bp 扩增片段或片段大小与目的片段大小不符，判定为阴性。 9 生物安全管理及废弃物处理 生物安全管理和废弃物处理应按照 GB 19489、NY/T 194 8 和 SN/T 4835 的规定执行。 DB34/T 4487 —2023 4 附录A （资料性） 试剂配制 A.1 1 ×TAE 电泳缓冲液 A.1.1 配制 50 ×TAE缓冲液 50 ×TAE 缓冲液 Tris 121 g