ICS65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3264—2018 农用微生物菌剂中芽胞杆菌的测定 Determination of Bacillus in agricultural microbial agents 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3264—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学、中国农业大学、中国农业科学院植物保护研究所、江苏省农业科学 院植物保护研究所。 本标准主要起草人：高学文、王琦、张杰、陈志谊、伍辉军、吴黎明、顾沁、束长龙、宋福平。 行业标准信息服务平台 H NY/T3264—2018 农用微生物菌剂中芽胞杆菌的测定 1范围 本标准规定了农用微生物菌剂中芽胞杆菌的检验方法。 本标准适用于农用微生物菌剂中芽胞杆菌的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 GB4789.2食品安 全国家标准 食品 生物学 GB20287—2006 农用微 3术语和定义 S 3. 1 芽胞杆菌纲 bacilli 细菌界（Ba 业生产，如芽胞 类弟胞杆菌属（Paenbacllhu）和短芽胞杆菌 杆菌属（Bacillu Brebacillu 本标准主要 包含芽胞杆菌属、类 芽胞杆菌属和短芽胞杆菌属。 3. 1. 1 芽胞杆菌属 分类地位：细菌界 霸面 菌门芽胞杆菌纲芽胞杆菌目（Ba 属 文兼性厌氧，菌体通常木 杆状。大多数能够运动，周生鞭毛，能形成 主要表型特行 1个内生芽胞。 3.1.2 类芽胞杆菌属 Paenibacllu 分类地位：细菌界厚壁菌门芽胞窗纲 杆菌目类芽胞杆菌科类芽胞杆菌 主要表型特征：革兰氏阳性， 好氧或兼 氰，菌杆状 数能够运 同生鞭毛，在多数培养 情况下不产生内生芽胞，但培养基 中添加混合盖 类如M 能促进其产生1个内生 芽胞。 3.1.3 短芽胞杆菌属Brevibacillus 分类地位：细菌界厚壁菌门芽胞杆菌纲芽胞杆菌目类芽胞杆菌科短芽胞杆菌属。 主要表型特征：革兰氏阳性，大多数好氧，菌体杆状。大多数能够运动，周生鞭毛，能形成1个内生 芽胞。 3.2 内生芽胞endospore 内生芽胞是某些细菌如芽胞杆菌在一定的环境条件下，能在菌体细胞内部形成一个圆形或卵圆形 休眠细胞，其能帮助细菌渡过逆境。 1 NY/T3264—2018 3.3 脂肽化合物lipopeptide 微生物通过非核糖体途径合成的一类化合物。这类化合物含有亲水的肽链和亲油的脂肪酸烃链， 从结构上可分为环状脂肽和线性脂肽。在芽胞杆菌中研究较多的是环状脂肽，主要有表面活性素（sur factin）、泛革素（fengycin）和杆菌霉素D（bacillomycinD）等。 3.4 伴胞晶体蛋白parasporalcrystalprotein 伴胞晶体蛋白是少数芽胞杆菌如苏云金芽胞杆菌，在形成芽胞的同时，会在芽胞旁形成一颗或多颗 双锥形、方形或不规则形的蛋白晶体。 3.5 菌落形成单位colonyformingunits,CFU 在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称 为菌落形成单位，以其计算单位体积中的活菌数量。 4试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水。 4.1主要溶液 4.1.1革兰氏染色剂：见附录A中的A.1。 4.1.2芽胞染色剂：见A.2。 4.1.3鞭毛染色剂：见A.3。 4. 1.4 石炭酸复红染色液：见A.4。 4.1.5 溴甲酚紫溶液：见A.5。 4.1.6 溴麝香草酚蓝溶液：见A.6。 4. 1.7 对氨基苯磺酸乙酸溶液：见A.7。 4.1.8 甲萘胺乙酸溶液：见A.8。 4.1.9 二苯胺试剂：见A.9。 4. 1. 10 二硝基水杨酸试剂：见A.10。 4.2培养基 4.2.1酵母粉胰蛋白陈培养基(LB)见附录B中的B.1。 信息服务平台 4.2.2厌氧培养基：见B.2。 4.2.3有 葡萄糖蛋白陈培养基：见B.3。 4.2.4 蛋白陈水培养基：见B.4。 4.2.5 淀粉水解培养基：见B.5。 4.2.6 明胶培养基：见B.6。 4.2.7 柠檬酸盐培养基：见B.7。 4.2.8T 丙酸盐培养基：见B.8。 4.2.9苯丙氨酸培养基：见B.9。 4. 2. 10 发酵培养基（Landy）：见B.10。 4. 2. 11 产胞培养基（SM)：见B.11。 4.2.12 无氮培养基（Ashby）：见B.12。 2 NY/T3264—2018 4.2.13赫奇逊氏培养基（Hutchinson）：见B.13。 5仪器设备 除微生物实验室常规容器、灭菌设备及培养设备外，其他设备如下： a）PCR仪。 b）电泳仪。 质谱仪。 c d) 酶标仪。 e) 气相色谱仪，配备氢火焰离子检测器 6试样的制备 PUBLI 6.1抽样 S 机和剪 微生物菌剂剂型的不 同，如固体类的粉剂、可湿性粉剂小落性 片剂 体类 悬乳剂 粉剂 、千悬浮剂、微乳 浴 剂等。抽样方法按照 的规定执行。抽样以 包装箱为一 装以 件。随机抽取3件 每代中心 随机抽取 的产品，应多抽几 ESE 件。大包装产品以 桶为 随机抽取 S 6.2样品制备 在无菌条件 上述抽 ，按四分法分装 ，每袋（瓶）不少 ARCH UR 7操作步骤 7.1试样的系列稀释卜 称取上述试样 液体菌剂取 10.0mL 加入90mL min 的无菌水中），静置 荡30mn 即得到 稀释度的菌悬 摇床l200/mm充 液。用无菌移液管吸耳 无菌水的 荡摇匀，得到 1×10°稀释度的菌惑 10稀释度的菌 液每 稀释度应更换 无菌移液管）。 7.2涂板及计数 分别吸取100uL上述各梯度稀液干 平板上，并用工形玻璃棒 均勾涂 整个平板表面，每1 稀释度做3次重复，然后置于3 ~37% 4h- 得到样品中芽胞杆菌 的菌量。 7.3确证试验 7.3.1菌种制备 自上述涂布计数中挑取5个特征的单菌落，画线接种于LB平板上.37℃培养48h左右。之后从每 一画线LB平板中选取至少1个良好分离的特征单菌落，转接保存，进行确证试验。 7.3.2形态观察 观察纯化菌落的形态特征，包括菌体颜色、表面和边缘特征、菌落的黏稠性等；挑选纯化的菌落做革 兰氏染色（4.1.1）、芽胞染色检测（4.1.2）和鞭毛染色（4.1.3）。 7.3.3生理生化确证试验 挑选纯化的菌落进行厌氧生长反应（4.2.2）、V-P反应（4.2.3）、产酸实验（4.2.4）、淀粉水解实验 （4.2.5）、明胶水解实验（4.2.6）、柠檬酸盐利用（4.2.7）、丙酸盐利用（4.2.8）、苯丙氨酸脱氨（4.2.9）、卵 3 NY/T3264—2018 黄反应、硝酸盐还原反应、pH适应性、7%NaCI适应性和温度适应性实验。 7.3.4分子生物学确证试验 以形态和生理生化基本表型特征为基础的细菌分类和鉴定有时不够稳定和准确，而基因水平的分 子遗传特征则客观准确地反映了微生物之间的亲缘关系。 利用细菌基因组提取试剂盒提取芽胞杆菌基因组DNA，用于基因扩增所需的模板。 7.3.4.116SrDNA基因扩增方法 采用细菌16SrDNA通用引物（附录C中的C.1进行PCR扩增。 PCR扩增程序：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，1min；34个循环72℃，10min。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，获得凝胶成像图谱，并切取目标条带回收PCR产物，送往测序公司 测序。 7.3.4.2gyrB基因扩增方法 采用细菌gyrB通用引物（C.1）进行PCR扩增。 PCR扩增程序：95℃，4min94℃,1min；62℃，1min；72℃，1min；34个循环；72℃，10min。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，获得凝胶成像图谱，并切取目标条带回收PCR产物，送往测序公司 测序。 7.3.4.3炭疽毒素和呕吐毒素合成基因扩增方法 采用炭疽毒素和呕吐毒素合成基因特异引物（附录C.1)进行PCR扩增。 PCR扩增程序：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，1min；34个循环72℃，10min。 PCR产物经凝胶电泳，获得凝胶成像图谱，并切取目标条带回收PCR产物，送往测序公司测序。 7.3.5菌种的几种重要活性物质的确证试验 7.3.5.1纤维素酶活的检测 a）刚果红染色法：芽胞杆菌活化后，挑取单菌落转接至装有5mLLB培养液的试管中，30℃~ 37℃、200r/min培养24h后，滴加5μL至以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的赫奇逊氏平板中的 灭菌滤纸菌碟上，37℃培养3d，以终浓度为1mg/mL的刚果红染料染色30min，再以1mol/L NaCI浸泡洗涤去除未结合的染料，测量并拍照记录形成透明圈的大小。 b）# 酶标仪法：将芽胞杆菌菌株转接至诱导产酶培养基中，30℃~37℃、200r/min培养48h，5000 g、4℃离心10min，取上清，便得到了粗酶液；检测内切萄聚糖酶酶活性时，首先取灭菌离心 管，加人200μL1%的凌甲基纤维素钠（溶于pH7.0磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液）作为反应底 物，并置于37℃金属浴上保温，吸取200L上述粗酶液稀释至合适浓度，与预热的底物涡旋混 合，于37℃金属浴上精确反应30min，立即取出加人500μL二硝基水杨酸试剂终止反应，并于 沸水中煮沸5