ICS 59.140.20 NY B 45 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3308—2018 动物皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of animal-derived materials in leather- QualitativerealtimePCRmethod 行业标准信息服务平台 2019-06-01实施 2018-12-19发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3308—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。 本标准主要起草人：步迅、范阳阳、刘艳艳、张全芳、胡悦、谷玉霞、马德源、李燕、杨雪、谭晴晴、陈雪 燕、刘国霞、王兴军。 行业标准信息服务平台 NY/T 3308—2018 动物皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 1 范围 本标准规定了利用实时荧光定性PCR法对水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山 羊）、貉子和家犬9种动物皮张源性成分进行检测 本标准适用于动物皮张及初加工品中水貂、孤狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山羊）、貉 子和家犬9种源性成分的定性检测 PUBLI 本方法检出限为1% 2规范性引用文件 下列文件对于 文件 用文仁其最新 件。凡是不注日期的引 本（包括所有的修改单） 分析实验室用水规格和试验方 GB/T 6682 实验质 GB/T 27403 量控制规范 食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定 本文作 3. 1 实时荧光PCR 体系中 在PCR反应 未知模板进行定 CENT 性或定量分析 CU 3. 2 Ct值cycle thr reshold 每个实时荧光PAR反应 历的循 4原理 根据线粒体16SrDNA基因在不间物间保守区设计通用引物，在可变 设计物种特异性探针， 采用TaqMan实时荧光POR技术进行护 增据P打增反应的荧光信 及循环阈值，判定水貂、狐 狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪 （绵羊、山羊貉子和家 大9种动物源性成分。 5试剂或材料 除另有规定外，仅使用分析纯试剂。 5.1水,GB/T6682,一级。 5.21mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl 调节pH至8.0,加水定容至100mL，103.4kPa(121℃)灭菌20min，室温保存待用。 5.31mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓 HCI调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，室温保存待用。 5.40.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液：称取18.61gNazEDTA·2H2O置于100mL烧杯中，加人 80mL水，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌后室温保存待用。 1 NY/T3308—2018 5.510%十二烷基硫酸钠（SDS)：称取10gSDS溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL。储存于 灭菌过的容器中待用。 5.65mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，在103.4kPa 蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存待用。 5.7细胞裂解液(LysisBuffer):取1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液20mL0.5mol/LEDTA(pH 8.0)溶液5mL,5.0mol/LNaCI溶液10mL，10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。 5.820mg/mL蛋白酶K溶液：称量0.2g蛋白酶冻干品，加水溶解，加水定容至10mL，分装后于 一20℃保存。 5.9RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至 室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。 5.10硅珠悬浮液：取5g的硅胶加人到20mL的水中充分混合，静止24h，弃掉上清液，再加人20mL 的水中充分混合，再静止5h，弃去上清液。在沉淀的硅珠中加人5mL的水，再加人5μL的浓盐酸，充 分混合，调节pH至2.0。 5.11DNA结合液（BindingBuffer)：称取60g异硫氰酸胍（GUSCN)，加人5mL1mol/LTris-HCI (pH6.4)溶液，再加人8mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液，再加人4mL聚乙二醇辛基苯基醚（Tri- tionX-100）（温度60℃），加水定容至100mL。 5.12漂洗液（WashingBuffer）：称取60g异硫氰酸胍（GUSCN)，加人5mL1mol/LTris-HCl(pH 6.4)溶液，再加人8mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加水定容至100mL。 5.1370%乙醇：量取70mL乙醇，加人30mL水。 8.0）溶液加人到50mL容量瓶中，调pH8.0，加水定容103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，降至室 温，4℃保存备用。 5.15水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山羊）、貉子和家犬9种动物源性成分实时荧 光PCR定性检测试剂盒试剂：2×TaqManMasterMix，含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20μL）、 Mg2+（终浓度2.0mmol/μL）、dNTPs（终浓度0.2mmol/μL）。水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、 猪、羊（绵羊、山羊）、貉子和家犬9种动物源性基因组DNA阳性标准品。 6仪器设备 信息服务平台 6.2紫外分光光度计：波长190nm~900nm 6.3电子分析天平：感量0.1mg。 6.4离心机：最大转速13000g。 6.5振荡型恒温金属浴：0℃~100℃。 6.6高压灭菌锅。 6.7低温冰箱：-20℃~4℃。 6.8超净工作台。 7检测用引物和探针 内参引物探针序列及水貂、狐狸、兔、牛（普通牛、黄牛）、马、猪、羊（绵羊、山羊）、貉子和家犬9种动 物的通用引物和特异性探针序列见附录A中的表A.1。引物探针在序列中的位置参见附录B。 2 NY/T 3308—2018 8试验步骤 8.1取样 在盐干皮或制皮张的平整边缘处取约4cm²大小试样，去除毛和脂肪，在无菌水中浸泡20min， 用无菌水清洗2次，将试样剪成直径约5mm小块，使用液氮研磨成粉末。 8.2DNA提取 称取30mg样品装人2mL的离心管中，每个样品设立2个平行样，加入400μL的DNA提取细胞 水浴2h，期间不时轻微摇匀。12000g，离心 裂解液（5.7），10uL蛋白酶K溶液（5.8），混勺， 5min，吸取上清液转至新的1.5mL高心管中，加入硅珠悬浮液10L（5.10）、加800μLDNA结合液 （5.11），充分混匀室温静置5min.8000g离心 上清液。加人700μL漂洗液（5.12），涡旋振 min，弃去 荡悬浮，8000g离心1min奔上清液。加人7的B0%4醇（5.13）洗涤8000g离心1min弃去上 清液，重复此步骤2次； 济液（5.855） 50μL0.1XTE缓冲液 5min8000g离心 RNA酶 专移至新的离心 1min，吸取上清液转 用紫外分光光度计检测提取的DNA 浓度与纯度，测定OD 和 值在1.7~1.9范围内 小，试验用 DNA浓控制在O 50 OngimL ESEAR 注：可采用经 动物组织 DNA提取武剂 创盒，按照使用说明书 8.3实时荧光PCR反应 8.3.1试样实时荧光PCR反应检测 8.3.1.1多重实时荧光 ABC3组PCR反 应体系进行多重实时荧 租包括水貂、 包金 狐狸和兔；B组包指 括牛马和猪：C组包括貉子、 和 每组PCR反应体 种动物源性的 特异引物探销 AT 加人内 8.3.1.2单重 时荧光PCR9种动物单重实时 CENT 8.3.2对照实时荧光PCR反应体系 在试样PCR 反应的同时 和阳性 a）阴性对照品：以9 b）空白对照：从水件 对 大和羊9种动物的 阳性对照品 因组DNA等量混匀 c) 作为阳性对 注：每个PCR反应设置 8.3.3实时荧光PCR反应体系配制 A.4和表A.5依次加人试剂，配制 PCR反应体系，混匀离心分装至 分别按照表A.2、表A.3、表 PCR反应管中，加人模板DNA，3000 HPOR管放人荧光定量PCR仪中。 取山 8.3.4实时荧光PCR反应程序 95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸35s（收集荧光信号），40个循环 9试验数据处理 9.1对照检测结果分析 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效： a）空白对照：A,B、C、D4组PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOE、ROX和CY5荧光的典型 扩增曲线； b) 阴性对照：A,B、C、D4组PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOE、ROX荧光的典型扩增曲 3 NY/T3308—2018 线；而CY5有典型扩增曲线，且Ct值≤35.0； c) 阳性对照：A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔中均出现FAM、JOE、ROX和CY5荧光的 典型扩增曲线，且Ct值<35.0。 9.2试样检测结果分析和表述 9.2.1在PCR反应体系有效且内参基因出现典型扩增曲线(Ct值<35.0)的情况下，当有FAM、JOE