ICS 65.020 CCS B 15 云 53 南 省 地 方 标 准 DB53/T 1082—2022 高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程 2022 - 05 - 20 发布 2022 - 08 - 20 实施 云南省市场监督管理局  发 布 DB53/T 1082—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC 07）归口。 本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。 本文件主要起草人：李婕、黄应昆、单红丽、王晓燕、张荣跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明。 I DB53/T 1082—2022 高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设 置、检测方法和结果判定等。 本文件适用于高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）侵染的植物样品的RT-PCR检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 高粱花叶病毒 Sorghum mosaic virus 高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属 （Potyvirus），是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghum mosaic virus，缩写为SrMV， 参见附录A。 3.2 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）的简称，是一 种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。 4 仪器与耗材 4.1 仪器 主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡 旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。 4.2 耗材 无核酸酶（Nuclease-free）的1.5 mL和2.0 mL离心管及0.2 mL PCR管等。 5 试剂 5.1 常规试剂 液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70% 乙醇、异丙醇、无水乙醇等。 1 DB53/T 1082—2022 5.2 RT-PCR 试剂 Oligo (dT)18 引物（0.5 µg/µL），RT-PCR反转录试剂盒，含溴酚蓝染料的2×EasyTaq PCR SuperMix 聚合酶混合物。 5.3 引物 5.3.1 上 游 引 物 SrMV-F ： 5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′ ， 下 游 引 物 5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′（R=A/G，Y=C/T）。 5.3.2 用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为 20 µM 的水溶液。 5.3.3 目的扩增片段约为 820 bp。 5.4 SrMV-R ： 电泳缓冲液的配制 按以下步骤配制电泳缓冲液： a) 称取 242 g 的 Tris，先用 300 mL 的 ddH2O 搅拌溶解后，加 100 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液 配制 50×TAE 储存液； b) 用 ddH2O 将储存液稀释 50 倍配制 1×TAE 工作液； c) 称取 Tris108 g、硼酸 55g、7.44 g 的 Na2 EDTA·2H2O，加入 40 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液， 再用 ddH2O 定容至 1 000 mL 配制 10×TBE 储存液； d) 用 ddH2O 将储存液稀释 20 倍配制 0.5×TBE 工作液。 5.5 扩增产物电泳检测试剂 1%左右（W/V）琼脂糖，核酸染料。 6 检测样品的取样及对照设置 6.1 阳性对照 以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。 6.2 阴性对照 以健康植物样品作为阴性对照。 6.3 空白对照 以灭菌ddH2O作为空白对照。 6.4 取样 戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污 染。 将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80 ℃冰箱保存备用。 7 检测方法 7.1 总 RNA 提取 总RNA提取步骤如下： 2 DB53/T 1082—2022 a) b) c) 7.2 戴一次性手套称取 0.1 g 待测样品置于灭菌研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入 1.5 mL 离心 管中，并对每支管进行编号； 用核酸提取试剂盒提取样品总 RNA，按提取试剂使用说明书进行操作； 提取后用蛋白/核酸分析仪测定 RNA 相对浓度，当 A260/A280 比值为 1.8～2.0 时，可用于 RT-PCR 检测。 反转录 按以下步骤进行反转录： a) 以提取的总 RNA 为模板，在 PCR 管中按序依次加入：Oligo (dT)18 引物约 0.5 µL、RNA 模板 约 2.0 μL（约 200 ng）、反转录试剂、灭菌 DEPC 水补足 10μL 反转录反应体系，混匀； b) 2 000 rpm 快速离心 10 s，放入 PCR 仪合成 cDNA，按 RT-PCR 试剂盒说明书进行操作。 7.3 PCR 扩增 按以下步骤进行PCR扩增： a) 以合成的 cDNA 第一链为模板，在 PCR 管中按序依次加入：灭菌 DEPC 水 7.2 μL、含溴酚蓝 染料的 2×EasyTaq PCR SuperMix 聚合酶混合物 10 μL、反转录产物（cDNA）2.0 μL、0.4 μL 上游引物 SrMV-F（20 μM）、0.4 μL 下游引物 SrMV-R（20 μM），制成 20 μL PCR 反应体系， 2 000 rpm 快速离心 10 s 混匀后放进 PCR 仪进行 PCR 扩增； b) 94 ℃预变性 5 min； c) 94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环； d) 72 ℃延伸 10 min。 7.4 琼脂糖凝胶电泳检测 按以下步骤进行： a) 用 1×TAE 或 0.5×TBE 缓冲液配制 1.0%左右（W/V）琼脂糖胶，加热至琼脂糖完全熔化； b) 待凝胶冷却至 50 ℃～60 ℃时，在 100 mL 琼脂糖胶中加入适量的核酸染料，混匀； c) 将凝胶倒入置有样品梳的制胶板上； d) 待凝胶充分冷却后，拔除样品梳，将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入装有 1×TAE 或 0.5×TBE 电泳缓冲液的水平电泳槽； e) 每个样品取 10 μL PCR 扩增产物加入样品梳孔，在其中一个样品梳孔中加入 6 μL DNA 分子量 标准（Marker E），130 V 恒定电压下电泳 25 min； f) 电泳结束后，把胶板取出用凝胶成像仪观察、拍照。 8 结果判定 阳性对照在820 bp左右有条带，阴性对照和空白对照无条带，则检测结果有效。RT-PCR检测结果 判定详见表1。 3 DB53/T 1082—2022 表1 RT-PCR 检测结果判定 判定条件 RT-PCR产物在820 bp左右有无条带出现（参见附录B） 序号 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 4 1 无 无 有 有 2 无 无 有 无 3 有/无 有/无 无 有/无 结果判定 检测结果有效，被检测甘蔗样品感染高粱花 叶病毒 检测结果有效，被检测甘蔗样品未感染高粱 花叶病毒 检测结果无效，将实验中的所有试剂更换， 并重新提取检测样品 RNA，进行 RT-PCR 检 测 DB53/T 1082—2022 附 录 A （资料性） 高粱花叶病毒 A.1 高粱花叶病毒 高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus） 成员，英文名称为Sorghum mosaic virus，缩写为SrMV。 A.2 病原特征 A.2.1 病毒粒体 SrMV病毒粒体呈弯曲线状，无包膜，螺旋对称结构，大小为（750～850）nm×（13～15）nm。 A.2.2 基因组 基因组由一条正单链RNA组成，大小约10 kb，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解后可产生10 个成 熟的蛋白质，从N端到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，还 在P3氨基端编码区发生移码翻译出P3N-PIPO。 A.3 寄主 在自然条件下，SrMV可侵染甘蔗（Saccharum officinarum）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）和细叶芒（Miscanthus sinensis）等禾本科植物。 A.4 病害症状 SrMV侵染为害叶片，花叶症状主要表现在叶片上，尤以新叶基部症状最为明显；病毒可系统侵染， 导致整丛蔗株发病，叶色褪绿，产生许多与叶脉平行的黄绿相间不规则条纹，大小长短不一，布满叶片， 与正常部分参差间隔成“花叶”；病株生长差、矮化、分蘖少，汁液量减少。 A.5 传播途径 SrMV可通过带毒的无性繁殖材料（种质）、田间病株及种传等方式传播，可通过收获机械、刀具 和摩擦接种等方式传播，也可被多种蚜虫（甘蔗棉蚜Ceratovacuna lanigera、黑豆蚜Aphis craccivora、 桃蚜Myzus persicae和玉米蚜Rhopalsiphum maidis）以非持久方式传播。 A.6 分布 主要分布于印度、美国、巴西、阿根廷、日本、菲律宾、澳大利亚、中国等国家。 5 DB53/T 1082—2022 附 录 B （资料性） 高粱花叶病毒 RT-PCR 检测电泳图 高粱花叶病毒RT-PCR检测电泳图见图B.1。 M：Marker E； 1-5：感染高粱花叶病毒的甘蔗样品； 6-10：未感染高粱花叶病毒的健康甘蔗样品； PC：SrMV阳性对照； NC：阴性对照； CK：空白对照。 图 B.1 高粱花叶病毒 RT-PCR 检测电泳图 6 DB53/T 1082－2022